越南安息香大小孢子发生和雌雄配子体发育

吴 君，李因刚，柳新红*，黄有军，石从广，陈庆标，张少伟

（1. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江农林大学，浙江 临安 311300；3. 浙江省建德市新安江林场，浙江 建德 311600）

越南安息香大小孢子发生和雌雄配子体发育

吴 君1，李因刚1，柳新红1*，黄有军2，石从广1，陈庆标3，张少伟3

（1. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江农林大学，浙江 临安 311300；3. 浙江省建德市新安江林场，浙江 建德 311600）

利用常规石蜡切片技术对越南安息香（Styrax tonkinensis）大小孢子发生及雌雄配子体的发育过程进行显微观察，结果表明：越南安息香花药4室，花药壁由内向外分别为绒毡层、中层、药室内壁和表皮；花药壁发育属于基本型，绒毡层属于腺质型；小孢子母细胞经减数分裂形成左右对称型四分体，胞质分裂为同时型，成熟花粉粒为2-细胞型，具有3个萌发孔；子房3室，胚珠多数，倒生，具双珠被，厚珠心，中轴胎座；大孢子母细胞经减数分裂形成线型四分体，3个大孢子退化，合点端的1个发育成大孢子，胚囊发育为蓼型；雄蕊发育早于雌蕊，开花后雌雄蕊趋于同熟。

越南安息香；大孢子；小孢子；雄配子体；雌配子体

越南安息香（Styrax tonkinensis）俗称“东京野茉莉”，属安息香科安息香属落叶乔木，为热带、亚热带阳性树种。总状花序，花白色成串，清香，花期4－6月；果实近球形，果序下垂，果期8－10月[1～3]。越南安息香是集药用、材用、油用和观赏等多种价值于一身的树种[4～8]，近几年引起了研究者的广泛重视，并从不同角度进行了大量研究[9～12]，但有关其生殖生物学，特别是生殖生长发育方面的基础性研究未见报道。本研究以江西吉水种源地的越南安息花芽为试验材料，对其大小孢子发生及雌雄配子体发育进行了观察研究，为越南安息香生殖和发育生物学、遗传育种提供相关理论基础，并为安息香科植物的胚胎学研究提供新资料。

1 材料与方法

1.1 材料与取样

材料为浙江省林业科学研究院苗圃内4年生越南安息香试验林（海拔31 m，120°01′ 29″ E，30°13′ 08″ N ），种源地为江西吉水。采样时间段为2012年4月11日（出现花芽）至5月13日（花开放），2 ～ 3 d采样1次。在林内随机选取5株健康植株进行采样，于树冠东南西北4个方向各采若干个花芽。采样完毕后立即带回实验室，洗净后放入70% FAA固定液中备用，常温条件下保存。

1.2 制样方法

用常规的石蜡切片法制片，LeciaRM2265轮转式自动切片机连续切片，厚度为8 ～ 12 μm，番红—固绿对染法染色，中性树胶封片，显微镜Olympus BX60观察组织切片，Olympus digital camera型相机拍照。试验于2012年8－11月在浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室进行。

2 结果与分析

2.1 小孢子发生及雄配子体发育

2.1.1 花药壁发育 越南安息香为圆锥花序，或渐缩小成总状花序（图1-1），每朵花具有4 ～ 10枚花药，多10枚，同大部分被子植物一样具有4个花粉囊（图1-2）。4月中旬，花芽开始萌动，此时形成的小花药是由一群有高度分裂能力的细胞组成。花药四个角隅分裂速度快，并形成体积大、细胞质浓、核大的孢原细胞，横切面上为四棱形，它的最外面分化出一层表皮（图1-3）。孢原细胞比其他的细胞大且分裂快，辐射向增大，经一次平周分裂形成初生周缘细胞（外层）与初生造孢细胞（内层）。初生周缘细胞再进行平周和垂周分裂，产生2层次生周缘层，靠近表皮的一层次生周缘细胞分化形成药室内壁和中层细胞，内侧一层次生周缘细胞分化形成中层和绒毡层细胞。至此，花药壁分化完成，从外向内依次由表皮细胞（1层）、药室内壁细胞（1层）、中层（2层）细胞及绒毡层细胞（图1-4）。根据Davis对被子植物花药壁形成方式的划分，其花药壁的发育属于基本型[13]。

随着小孢子母细胞减数分裂及花粉粒的形成，花药壁发生了一系列变化。越南安息香花粉囊表皮宿存，随着花药的发育而体积增大。药室内壁不发达，退化（图1-5），在整个花药发育过程中未见药室内壁加厚形成纤维层。中层壁细胞在花粉母细胞减数分裂时逐渐解体而被吸收。绒毡层在整个发育过程中原生质体始终保持在原位。在花粉母细胞减数分裂期间，绒毡层体积逐渐增大，细胞质进一步变浓，细胞近方形，排列整齐（图1-6）；四分体时，有解体现象（图1-7）；单细胞时期，绒毡层细胞解体明显（图1-8）；到花粉成熟，绒毡层完全解体（图1-9）。可以看出，其细胞是原位解体，属于腺质绒毡层。

2.1.2 小孢子的发生 初生造孢细胞不断进行减数分裂，发育形成体积大、细胞核大的小孢子母细胞（图1-10）。小孢子母细胞经过减数分裂Ⅰ后，形成2个细胞核且不形成细胞壁（图1-11、图1-12）。减数分裂Ⅱ后，形成四分体，4个子细胞共同处于一个胼胝壁内（图1-13、图1-14、图1-15、图1-16），其胞质分裂为同时型。

2.1.3 雄配子体发育 随着胼胝质壁溶解，小孢子彼此分开，被释放到花药腔中。刚从四分体中分离的小孢子细胞壁薄，细胞质浓，细胞核大且位于细胞中央（图1-18）。随后小孢子细胞质形成一个中央大液泡，细胞核被挤到细胞边缘，花粉壁加厚，逐渐成为单核靠边期小孢子（图1-19）。此后，小孢子进行不均等胞质分裂，形成的大的营养细胞核和小的生殖细胞（图1-20）。随着雄配子体的发育，生殖细胞游离在营养细胞之中。成熟花粉为2-细胞型，具有3个萌发孔（图1-21）。

2.2 大孢子发生和雌配子体发育

2.2.1 胚珠发育 4月底越南安息香花芽形成雌蕊原基后，生长分化，形成柱头、花柱及子房。柱头三裂（图

图1 小孢子发生及雄配子体发育

2-1），为湿型柱头；开放型花柱（图2-2），花柱中有花柱道。子房3室，胚珠多枚（图2-3），胚珠是由胎座上的胚珠原基发育而成的，子房内表皮下的一些细胞产生一团具有强裂分裂能力的细胞突起，称为胚珠原基。（图2-4）。原基向上生长，前端发育成珠心，基部发育成珠柄，与胎座相连，胚珠生长时，珠柄和其他部分的生长速度并不一致，因此着生方位不同。越南安息香的胚珠为倒生胚珠，整个胚珠180°扭转，呈倒悬状。

2.2.2 大孢子发生 子房发育早期，其内室中央表皮出现一微突起，即为胚珠原基（图2-4）。随后珠心表皮下出现1个体积大、细胞质浓且核大的孢原细胞（图2-5）。孢原细胞进行平周分裂产生1个周缘细胞和1个造孢细胞（图2-6）。造孢细胞扩大直接发育成大孢子母细胞。大孢子母细胞核大、细胞质浓厚，进行减数分裂。经2次减数分裂后产生4个单倍体大孢子（图2-7），近珠孔的3个细胞退化，合点端的一个发育成功能大孢子（图2-8）。

2.2.3 雌配子体发育 雌配子体是由功能性大孢子发育而来的。合点端的功能性大孢子继续发育，形成单核胚囊，单核胚囊体积继续增大。单核胚囊经过第一次有丝分裂，形成二核胚囊（图2-9），再经过第二次有丝分裂形成四核胚囊（图2-10），继而经过最后一次有丝分裂形成八核胚囊。在成熟的胚囊中可见1个卵细胞和2个助细胞呈品字形排列，三者合一，称为卵器。2个助细胞细胞质浓厚，相互排列紧密。在胚囊中央可见中央细胞的2个极核相互融合，形成1个大的次生核。合点端的三核为反足核（图2-11、图2-12、图2-13）。综上所述，可见越南安息香的胚囊发育类型属于蓼型。

图2 大孢子发生和雌配子体发育

2.3 雌雄蕊发育时间段对比 在越南安息香雌、雄蕊发育过程中，雄蕊发育较早，而雌蕊发育相对较迟缓，小孢子母细胞减数分裂时期，雌蕊胚珠原基才处于发育阶段。小孢子四分体时，大孢子母细胞才形成。雌蕊后期发育加快，与雄蕊达到同熟，见表 1。由此可见，越南安息香的雌雄蕊发育并不同步。

表1 雌雄蕊发育时期

3 结论与讨论

植物的有性生殖对产生有机后代和维持物种延续起绝对性的作用[14]。越南安息香花药壁的发育属于基本型。从外向内依次由表皮细胞（1层）、药室内壁细胞（1层）、中层（2层）细胞及绒毡层细胞组成。相关研究中，北柴胡（Bupleurum chinenes）、阿月浑子（Pistacia vera）、楸（Catalpa bungei）[15～17]等大多物种在花粉壁发育时，药室内壁会加厚，最后形成纤维层。而越南安息香的药室内壁在整个花药发育过程中未见加厚形成纤维层，而是到花粉成熟时退化。这种现象在红直獐牙菜（Swertia erythrosticta），川东獐牙菜（Swertia davidii）[18～19]中已有报道。这可能是由于药室内壁不发达造成的，致使药室内壁细胞在花粉发育过程中被完全吸收。越南安息香小孢子母细胞在减数分裂中胞质分裂为同时型，产生左右对称四分体；成熟花粉为二细胞型，有3个萌发孔。

越南安息香柱头三裂，湿型柱头，花柱中有花柱道。子房3室，胚珠多枚，倒生胚珠；双珠被，厚珠心。成熟的胚囊中2个助细胞和1个卵细胞呈品字形排列构成卵器，中央细胞的2个极核在胚囊中央融合，形成1个大的次生核，合点端的三核为反足核。胚囊发育属于蓼型。山矾科与安息香科在亲缘关系上比较密切，研究表明，华山矾（Symplocos chinens）[20]的胚囊发育也属于蓼型，这与越南安息香的胚囊发育相一致。在越南安息香雌、雄蕊发育过程中，雄蕊发育较早，而雌蕊发育相对较迟缓，雌蕊后期发育速度加快，与雄蕊达到同熟。本研究报道了越南安息香的雌雄配子体发育及大小孢子形成，在整个发育过程中未见明显的异常现象，可为今后系统分类提供有意义的胚胎学证据。

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Megasporogenesis, Microsporogenesis and Development of Male and Female Gametophytes in Styrax tonkinensis

WU Jun1，LI Yin-gang1，LIU Xin-hong1*，HUANG You-jun2，SHI Cong-guang1，CHEN Qing-biao3，ZHANG Shao-wei3
（1. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 3. Jiande Xin’anjiang Forestry Farm of Zhejiang, Jiande 311600, China）

The megasporogensis, microsporogenesis and development of male and female gametophytes of Styrax tonkinensis were observed by paraffin section technique. The results showed that anthers is 4-sporangiate, and the wall of anther consists of tapetum, middle layers, endothecium and epidermis from inside to out. The development of anther has classified into basic and the tapetum cell is glandular tapetum. The microspore mother cells give rise to isobilateral tetrads by meiosis. Cytokinesis is simultaneous. Mature pollen grain is 2-cell type with three germ pores, with ovaryis trilocular. The ovule is anatropous, bitegmious, crassinucellate axile placenta. The chalazal megaspore in a linear tetrad becomes megaspore. The development of embryo sacs belonges to polygonum type and the stamen was earlier than that of pistil, they synchronized after blossom.

Styrax tonkinensis; megasporogensis; microsporogenesis; male gametophytes; femalegametophytes

S718.43

A

1001-3776（2014）01-0047-05

2013-07-09；

2013-11-10

浙江省省院合作林业科技项目（2010SY05）；浙江省创新团队建设与人才培养项目（2010F20014）；浙江省重大科技专项重点项目（2008C12019）

吴君（1988－），女，浙江上虞人，硕士生，从事观赏植物资源研究；*通讯作者。