灯盏花素对糖基化终产物条件下缝隙连接蛋白的影响及相关机制研究

石 峻周冰之宋 珈王 俊

1浙江中医药大学附属第二医院急诊科 杭州 310005 2浙江中医药大学

灯盏花素对糖基化终产物条件下缝隙连接蛋白的影响及相关机制研究

石 峻1周冰之1宋 珈1王 俊2

1浙江中医药大学附属第二医院急诊科 杭州 310005 2浙江中医药大学

目的 观察灯盏花素对糖基化终产物（AGEs）条件下心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43（Cx43）的影响及相关机制。方法 取出生3天SD乳鼠心肌细胞原代培养，用AGEs处理心肌细胞，相同条件下牛血清白蛋白（BSA）处理为对照，Western blot检测不同条件下Cx43表达量、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）蛋白表达。结果 AGEs处理心肌细胞后，Cx43表达量下降（P＜0.05），丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路ERK磷酸化水平升高（P＜0.05），灯盏花素能够抑制AGEs诱导的Cx43表达量下降（P＜0.05），同时能够抑制ERK磷酸化水平。结论 灯盏花素对AGEs诱导缝隙连接蛋白43表达下调有干预作用，这可能与灯盏花素抑制ERK信号通路激活相关。

大鼠；灯盏花素；糖基化终产物；缝隙连接蛋白43；心肌细胞

心肌细胞之间电信号有序传导依赖于细胞之间的缝隙连接（gap junction，GJ），而缝隙连接主要由缝隙连接蛋白（connexin，Cx）构成。迄今在哺乳动物中已发现的有20种，其中Cx43是心肌细胞中最主要的缝隙连接蛋白[1]。糖尿病环境下Cx43表达异常会导致心肌细胞之间电偶联的紊乱及心律失常。糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）在糖尿病心血管并发症中发挥重要作用。AGEs能够诱导心肌细胞Cx43表达量下降，这可能与糖尿病患者心律失常发病率相关[2]。灯盏花素是从中药灯盏细辛中提取出的活性成分[3]，具有扩血管、抗血栓及缺血再灌注损伤作用[4]，但其对AGEs诱导心肌细胞Cx43表达量下降有无保护作用，目前尚未见相关文献报道。本研究观察灯盏花素对糖基化终产物（AGEs）条件下心肌细胞缝隙连接蛋白43的影响及相关机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级健康3天龄Sprague-Dawley大鼠25只，随机分为5组，各5只，体质量（270±20）g，由浙江中医药大学动物中心提供。动物合格证号：00594110。

1.2 药物及试剂 低糖DMEM培养基购自杭州吉诺生物有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；灯盏花素购自上海融禾生物工程有限公司，ERK，p-ERK多克隆抗体购自Cell Signaling公司；Cx43，cardiac aactin单克隆抗体，小牛血清白蛋白（BSA），MAPK激酶MEK1和MEK2的高效选择性抑制剂（PD98059），5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu），D-葡萄糖均购于Sigma公司，II型胶原酶购自美国Gibco公司。

2 实验方法

2.1 乳鼠心肌细胞原代培养 选取3天龄SD大鼠，每只大鼠分别取出心脏，取心尖前1/3部分，剪成1mm3左右细小颗粒，用0.05%mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）反复清洗；用含0.125%胰酶和0.1%II型胶原酶混合消化酶反复消化，每次5min，吸取上清液后用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和，直到心肌组织消化完全；离心后加入红细胞裂解液，再次离心后接种于培养皿中，置于37°C，5%CO2培养箱中孵育1h，通过差速贴壁将心肌细胞悬液接种于新的培养皿中，以移除成纤维细胞。24h后加入0.01mmol/L 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu），抑制成纤维细胞生长，48h后换液备用。光镜下可见成片搏动心肌细胞。

2.2 AGEs制备 参照文献[5]方法，0.5g BSA，3.0g D-葡萄糖，溶于10mL 0.5mol/L PBS（pH7.4）中，通过0.22μm滤膜过滤除菌，37℃恒温培养箱避光孵育16周。相同条件下不含D-葡萄糖的PBS孵化BSA作为对照，测定内毒素含量并确保＜2.5U/mL。

2.3 标本分组 用制备好的浓度为 100μg/mL AGEs处理上述5组心肌细胞悬液，观察1h内不同时间节点心肌细胞MAPK信号通路中ERK磷酸化水平变化。其中1组加入40mg/L灯盏花素液作为观察组，其余4组（各5份）心肌细胞悬液分别为空白对照组、BSA组、AGEs（48h）组及AGEs（72h）组。

2.4 Western blot检测相关蛋白表达 收集心肌细胞后，用含磷酸酶抑制剂，混合蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30min，13 000g，4℃离心10min，吸取上清，BCA法蛋白定量。每组取30～60μg蛋白进行SDS-聚丙烯凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉TBS-T封闭1h，加入相应一抗（Cx43，ERK，p-ERK）4℃孵化过夜。TBS-T洗10min×3次，加入含辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，洗膜，ECL法显色，采用LAS-4000-mini化学发光成像系统进行扫描和灰度分析。

3 实验结果

3.1 AGEs对心肌细胞MAPK信号通路ERK磷酸化水平的影响 心肌细胞原代培养72h，予100μg/mL AGEs处理，在不同时间点（0，15，30，60min）收取细胞，Western blot检测ERK磷酸化水平。结果显示，AGEs能够诱导ERK磷酸化水平升高，在15～30min达峰（n=3，P＜0.05，vs对照组），然后下降。见图1。

图1 AGEs对心肌细胞MAPK信号通路ERK磷酸化水平的影响注：与对照组比较，*P＜0.05

3.2 AGEs诱导下各组Cx43及GAPDH表达 用100μg/mL AGEs处理心肌细胞，与空白对照组及BSA组（100μg/mL）比较，AGEs组Cx43表达受到明显抑制，并有一定的时间依赖性（P＜0.05）。但AGEs+灯盏花素组（在AGEs孵育时加入40mg/L灯盏花素）与AGEs（72h）组比较，AGEs+灯盏花素组Cx43表达量有所恢复（P＜0.05），这表明灯盏花素能显著抑制AGEs诱导的心肌细胞Cx43表达量下降。见图2。

4 讨论

图2 各组对AGEs诱导Cx43（KD）及GAPDH（KD）表达的影响注：与对照组、BSA组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与AGEs（72h）组比较，#P＜0.05

缝隙连接是普遍存在的一种细胞连接方式，主要通过缝隙连接蛋白介导。人缝隙连接蛋白基因家族有21个成员，其中，心肌细胞中表达最高的为Cx43。研究[6]表明，糖尿病尤其糖尿病心肌病易导致量下降，但与灯盏花素共孵育能够对抗此作用，同时灯盏花素能够抑制AGEs诱导的ERK信号通路激活。因此，我们认为灯盏花素可能通过抑制ERK磷酸化从而抑制AGEs诱导的心肌细胞Cx43表达量下降，但对心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43分布有无影响尚需进一步研究，该研究结果还需动物实验进一步验证。心律失常，持续性室颤发病率偏高，心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43表达减少，细胞间电信号传导偶联紊乱，且易出现低血钾，从而导致室颤发生率升高。通过对STZ诱导的糖尿病大鼠模型研究发现，造模3周后，糖尿病大鼠1～2周后Cx43表达无变化[7]，3周后Cx43表达下降，而12周后表达增加[8]，实验结果不统一表明糖尿病是一个复杂的病理生理过程，在疾病的不同阶段有多种病理因素参与其中，且STZ诱导的糖尿病大鼠模型为1型糖尿病模型，并非临床常见的2型糖尿病模型。

糖基化终产物（AGEs）是糖尿病状态下多种蛋白质等大分子通过非酶糖基化反应所形成的终产物。AGEs能够与其受体RAGE结合或通过非受体途径介导一系列糖尿病心血管并发症。研究[9]发现，AGEs能够诱导肝癌SKHeP 1细胞缝隙连接蛋白Cx32、Cx43表达量下降，这可能是通过MAPK信号通路中的ERK和JNK信号通路完成。但AGEs对心肌细胞缝隙连接蛋白相关研究偏少。本研究发现，AGEs能够诱导心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43表达量下降，同时AGEs能够诱导ERK信号通路激活，而使用ERK信号通路能够抑制AGEs诱导的心肌细胞Cx43表达量下降。这说明AGEs可能通过ERK信号通路抑制心肌细胞Cx43蛋白表达。

灯盏花素广泛应用于心脑血管疾病的辅助治疗。本研究发现，AGEs能够诱导心肌细胞Cx43表达

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［2］孙明谨，文重远，黄婷，等.糖尿病大鼠心肌Cx43的表达及缬沙坦对其影响［J］.中国现代医学杂志，2009，19（15）：2294-2297.

［3］高洋洋，赖勇.药物代谢酶和转运蛋白介导的灯盏花素药物相互作用研究进展［J］.中国医院药学杂志，2014，33（1）：76-79.

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Effect of Breviscapine on Reduced Connexin 43 Expression by Advanced Glycation End Products in Ratsand the Related Mechanism

SHI Jun1,ZHOU Bingzhi1,SONG Jia1,WANG Jun2. 1.Department of Emergency, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2.Zhejiang Chinese Medical University.

Objective To investigate the effect of breviscapine on connexin 43（Cx43）expression reduced by advanced glycation end products（AGEs）in rat cardiomyocytes.Methods Cardiomyocytes were obtained from 3-day-old Sprague-Dawley rats and cultured.The cultured cardiomyocytes were treated with AGEs or BSA as controls.The expression of Cx43,extracellular signal regulated kinase（ERK）,and phosphorylated-ERK（p-ERK）was measured by western blot.Results After cardiomyocytes treated with AGEs,the level of protein Cx43 was downregulated（P＜0.05）,but the expression of ERK and p-ERK was increased（P＜0.05）.The expression of Cx43 was increased when cardiomyocytes were co-incubated with breviscapine in AGEs-treated group.Pretreatment with breviscapine suppressed AGE-induced ERK phosphorylation.Conclusion Breviscapine can inhibit AGEs-induced low expression of Cx43 in rat cardiomyocytes,which may relate to the breviscapine-suppressed AGE-induced ERK phosphorylation.

rats；breviscapine；advanced glycation end products；connexin 43；cardiomyocytes

2014-04-25

修回日期：2014-09-03

周冰之，Tel：13575737751；E-mail：zhoubz@163.com