炙马钱子对自身免疫性重症肌无力模型大鼠免疫调节机制研究

邹 莹裘 涛杨 峰

1浙江中医药大学附属第二医院临床心理科 杭州 310005 2浙江中医药大学附属第一医院神经内科 3浙江中医药大学

炙马钱子对自身免疫性重症肌无力模型大鼠免疫调节机制研究

邹 莹1裘 涛2杨 峰3

1浙江中医药大学附属第二医院临床心理科 杭州 310005 2浙江中医药大学附属第一医院神经内科 3浙江中医药大学

目的 探讨炙马钱子对实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）模型大鼠的免疫调节机制。方法 采用鼠源乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段方法免疫Lewis大鼠建立EAMG模型，观察实验大鼠的临床表现，并将建模成功的EAMG大鼠随机分为模型组、强的松组及炙马钱子低、中、高剂量组，每组8只。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组大鼠血清乙酰胆碱受体抗体（AChRab）和白介素6（IL-6）含量比较各组之间差异。结果 模型组大鼠血清AChRab和IL-6含量较正常组显著升高（P均＜0.01）。炙马钱子高剂量组AChRab含量较中、低剂量组下降更显著（P均＜0.01），与强的松组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；炙马钱子中、高剂量组IL-6含量均低于强的松组（P均＜0.01）；炙马钱子中、高剂量组间IL-6含量差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 炙马钱子能降低EAMG模型大鼠血清AChRab和IL-6含量，抑制T、B细胞活化，减轻对突触后膜AchR的损害，缓解EAMG病情，一定剂量范围内的炙马钱子在免疫调节方面表现优于强的松。

大鼠；自身免疫性重症肌无力；乙酰胆碱受体抗体；白细胞介素6；炙马钱子；强的松

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种神经-肌肉接头传递障碍的获得性自身免疫性疾病，主要是由血清中乙酰胆碱受体抗体（AChRab）增高和在突触后膜上的沉积导致有效AChR数目减少而引起的受累肌群无力的症状。目前西医主要有长期的胆碱酯酶抑制剂、激素及免疫抑制剂治疗，静脉注射丙种球蛋白、血浆置换、胸腺切除等疗法。中医则主要以“精不足，则补之以味，而形不足，则温之以气”为治法进行药物配伍。浙江省中医院将炙马钱子作为院内制剂用于治疗重症肌无力已有三十余年，取得较好的临床疗效，未见明显不良反应。从国内已有的少数报道来看，马钱子治疗MG有初步疗效。本实验通过对炙马钱子治疗实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）大鼠的观察，初步揭示其治疗MG的免疫调节机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 雌性8周龄的Lewis大鼠50只，浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002，体质量208～256g。SPF级条件下饲养于浙江中医药大学动物实验中心，灭菌水及饲料供动物自由摄入。

1.2 主要药物 炙马钱子胶囊（生产批号130320，浙江省中医院，批准文号：浙药制字Z20100263），200mg/粒；新斯的明注射液（生产批号11071，上海信谊金朱有限公司，批准文号：H31022770），1mg/支；阿托品注射液（生产批号20120622，浙江瑞新药业股份有限公司，批准文号：H33020456），0.5mg/支；强的松片（生产批号120807，浙江仙琚制药股份有限公司，批准文号：H33021207），5mg/片，实验时用0.2%的梭甲基纤维素钠将其配制成所需浓度的混悬液。

1.3 主要试剂 鼠源性乙酰胆碱受体-a亚基97-116肽段序列（the rat sequence 97-116 of the AChR a subunit，R97-116）、完全福氏佐剂（CFA）、磷酸缓冲液（PBS），大鼠IL-6（货号CK-E30646R）、AChRab（货号CK-E30324R）ELISA检测试剂盒。

2 实验方法

2.1 EAMG动物模型建立 参考许文华等[1]的R97-116复制EAMG实验动物模型。将R97-116、CFA、PBS三者按1:1.5:1.5的比例充分混匀制成免疫乳剂；首次免疫：取乳剂200μL（含R97-116:100μg）于造模鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射，正常对照组皮下注射等量PBS；首次免疫后第30天及第45天，取乳剂200μL（含R97-116:50μg）强化接种，A组注射等量PBS。

2.2 EAMG动物模型评估

2.2.1 临床评估 通过测量体质量和肌力来评价疾病严重性。①实验前及接种后每周2次称重，末次免疫2周后观察其摄食、姿势及活动情况；②测量肌力（即让鼠重复抓握笼顶30s再测量）采用Lennon等[2]的分级法予以临床评分，肌力具体分级为：0级，无肯定的肌无力表现；1级，撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少且容易疲劳；2级，明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背，抓握力弱；3级，在抓握前即有严重的肌无力表现，无力抓握，频死状态；4级，死亡。症状居中间者分别评分为0.5、1.5、2.5和3.5级。

2.2.2 新斯的明试验 用腹腔注射法给予新斯的明（37.5μg/kg）和硫酸阿托品（15μg/kg），12min后大鼠肌无力症状可缓解，持续2～12h。

2.3 实验动物分组及处理 从50只大鼠中随机取8只作为正常组，其余42只进行EAMG造模。在R97-116免疫大鼠的第2周末，对实验大鼠进行模型评估，确定建模成功40只。然后，将这40只EAMG成模大鼠随机分为模型组、阳性药物组（强的松组）、炙马钱子低、中、高剂量组，每组8只。炙马钱子低、中、高剂量组分别以75、150、225mg/（kg·d）的剂量（分别按照50kg成人每日用药为0.6g、1.2g和1.8g剂量换算）灌胃治疗，每天1次；阳性药物对照组以强的松4mg/（kg·d）的剂量（按照50kg成人每日用药30mg剂量换算）灌胃治疗，每天1次；正常组、模型组称重后给予药液等量的蒸馏水灌胃，共治疗28天。实验过程中炙马钱子高剂量组于灌胃后次日死亡2只大鼠，故最后确定送检标本为5只，其余各组均6只。

2.4 检测指标及方法 各组治疗28天后，禁食12h；采用眼球取血法取静脉血1.5mL，静置30min后，经3000rpm，离心10min，取上层血清，放置-20℃冷冻保存待测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法分别检测体液免疫指标乙酰胆碱受体抗体（AChRab）及细胞免疫指标白细胞介素6（IL-6）。

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，实验数据以均数±标准差（±s） 表示；对于总体分布不明的小样本资料，各组间结果的比较采用非参数检验，若符合正态分布且方差齐性的则采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 一般状况观察 正常对照组8只大鼠均未出现肌无力症状；其余大鼠在接受R97-116免疫后的第1周均出现了短暂性的肌无力症状，且未经治疗可自行缓解；第二次免疫后，部分大鼠出现进食减少，精神萎靡，活动减少等表现，但是肌无力表现不典型；追加免疫后，多数实验大鼠表现叫声低弱，对环境刺激反应迟钝，少动，毛发干枯，嘶咬无力且易疲劳，蜷缩拱背，四肢的肌无力症状比较典型，但无呼吸困难，脱水等危重表现。采用新斯的明试验及Lennon评分法对末次免疫2周后的大鼠进行评估，新斯的明试验阳性率95.24%（42只大鼠中有40只试验阳性），Lennon临床评分0.5～2级，以评分1级及以上为肌无力阳性，阳性率83.33%（其中1级大鼠26只，2级大鼠9只）。因此，最后确定EAMG建模成功的大鼠共40只。

3.2 各组大鼠血清AChRab含量比较 模型组大鼠血清AChRab含量明显升高，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；药物干预后，各组AChRab含量均有下降，其中强的松组和炙马钱子高剂量组比模型组显著降低（P＜0.01），炙马钱子低剂量组AChRab含量显著高于强的松组（P＜0.05），炙马钱子高剂量组AChRab含量明显低于中、低剂量组（P均＜0.01），虽略低于强的松组，但组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清AChRab含量比较（±s）

表1 各组大鼠血清AChRab含量比较（±s）

注：与模型组比较，△P＜0.01；与强的松组比较，*P＜0.05；与高剂量组比较，▲P＜0.01

n/只组别正常组模型组强的松组炙马钱子低剂量组炙马钱子中剂量组炙马钱子高剂量组666665 AChRab/（pmol/mL）106.757±11.874△212.082±22.987 126.860±7.040△184.903±16.384*▲148.378±9.689▲124.566±9.138△

3.3 各组大鼠血清IL-6含量比较 模型组大鼠血清IL-6含量显著升高，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；药物干预后，各组IL-6含量均较模型组显著降低（P＜0.01）；炙马钱子中、高剂量组IL-6含量均低于强的松组（P均＜0.01）；炙马钱子中、高剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-6含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清IL-6含量比较（±s）

注：与模型组比较，△P＜0.01；与强的松组比较，*P＜0.01

组别正常组模型组强的松组炙马钱子低剂量组炙马钱子中剂量组炙马钱子高剂量组n/只666665 IL-6/（pg/mL）47.645±10.215△111.815±7.149 99.268±5.956△94.992±6.029△82.548±4.888△* 75.976±6.016△*

4 讨论

MG确切的发病机制至今仍不完全明确。研究表明，它可能是一种由多基因调控、多种机制参与的复杂性疾病[3]。

药理研究证实，马钱子的主要成分士的宁能选择性地提高脊髓兴奋功能，治疗剂量能使脊髓反射的应激性提高，反射时间缩短。神经冲动容易传导，骨骼肌的紧张度增加，从而使肌无力状态得到改善[4]。

MG发生的关键在于机体针对AChR发生的免疫应答异常。因此，AChRab是引起MG的重要因素之一，也是本实验造模的主要理论依据。AChR多存在于神经肌肉接头的突触后膜、部分前膜、神经节细胞突触表面等处，AChRab与AChR结合后使得AChR降解加快，导致突触后膜AChR数量减少，影响神经肌肉接头功能。研究[5-6]发现，AChRab可能通过三种机制影响神经肌肉的连接功能：①与AChR结合触发补体瀑布链，进而形成膜攻击复合体（MAC），引起神经肌肉接头（NMJ）处突触后膜的局部破坏；②在NMJ突触后膜与AChR分子产生交叉联合导致AChR分子的细胞内吞和降解作用；③与AChR上的ACh位点结合，阻断NMJ突触后膜AChR与ACh的正常联合。本实验中模型组大鼠血清AChRab含量明显高于正常组（P＜0.01）。药物干预后，各组AChRab含量均有下降，提示炙马钱子和强的松都通过降低AChRab含量改善MG病情。强的松组和炙马钱子高剂量组大鼠血清AChRab含量无明显差异（P＞0.05），说明炙马钱子降低AChRab含量效果与强的松相当。

IL-6是B细胞分化成浆细胞的关键因子，由Th2等多种细胞分泌，其受体广泛表达于多种组织细胞，作为参与免疫应答的重要炎症介质，在细胞因子网络发挥多种效应[7]。动物研究已证实[8]，IL-6一方面可加强MHCⅡ表达，作用于活化后期的B细胞，激活Ig重链启动子大量合成分泌型Ig mRNA，从而增加抗体Ig（IgM、IgG、IgA）的分泌；另一方面可诱导T细胞活化、增殖和分化，促进T细胞IL-2产生及表达IL-2R等过程，在体液免疫和细胞免疫中发挥着重要作用。研究[9]表明，MG患者血清IL-6水平显著高于对照组，且MG症状改善者其血清IL-6水平也明显下降。说明IL-6在MG发病中起促进作用[10]。本实验中，EAMG模型鼠血清IL-6含量相比正常组显著升高（P＜0.01），这与大多数文献结果一致。这可能是MG患者体内AChR自身抗原刺激了机体免疫系统，使表达和分泌IL-6的AChR特异性T细胞被激活，分泌大量IL-6，并诱导B细胞增殖和分化，促进B细胞分化成浆细胞，产生大量的AChRab，导致MG发病。因此，IL-6通过促进AChRab的产生而对MG的发生、发展起着非常重要的作用。经药物治疗后各组IL-6含量出现不同程度的下降，说明炙马钱子和强的松对降低EAMG大鼠血清IL-6含量都有明确疗效，而且炙马钱子中、高剂量组比强的松组含量更低（P＜0.01）。

MG属于中医“痿证”范畴，该病病因复杂，多由先天禀赋不足，后天供养失调等因素导致肝脾肾功能失调而形成。病机方面，脾胃为后天之本，气血生化之源，脾主四肢肌肉，脾虚则脾胃受纳、腐熟、运化输布水谷精微的能力不足，气血津液生化乏源，无以濡养五脏六腑，肌肉筋脉失养，出现提睑无力，四肢痿软。肝藏血，开窍于目，主筋，为罢极之本；肾藏精，主骨，为作强之官。若肝血亏虚，血不养筋，罢极无本，则宗筋弛纵不能耐劳；肝血不足，精明失养，故见复视、斜视。另外乙癸同源，肝肾为病，常相互影响，肝血不足，可致肾精亏损；肾虚精亏，水不涵木，非惟肝肾俱亏，亦且生风动血，气机乖乱，聚津生痰，肝风挟痰阻滞经络，筋脉肌肉失养亦致驰缓痿废。

马钱子味苦性寒，虽毒性强烈，但长于开通经络，通达关节，若炮制得宜，用量恰当，对MG有起痿振颓之效。其机制可能与士的宁能选择性提高脊髓兴奋功能，治疗剂量能使脊髓反射的应激性提高，缩短反射时间，神经冲动容易传导，骨骼肌紧张度增加，从而改善肌无力状态有关。但马钱子的治疗量与中毒量非常接近，虽经过浸泡、油炒、晾干、打粉、消毒等制备过程以降低毒性[11]，但超过一定剂量仍可中毒。本实验中炙马钱子高剂量组大鼠死亡2只，可能就与药物浓度过高有关。因此，采用炙马钱子治疗MG时，剂量判定非常重要，一定范围内的高剂量药物，能够增强疗效；反之，毒副作用也相应增加[12]。

综上所述，炙马钱子能一定程度地降低EAMG大鼠血清AChRab和IL-6含量，抑制T、B细胞活化，从而减轻对突触后膜AchR的损害，缓解EAMG病情，其作用与强的松相似，可能通过抑制免疫活化而达到治疗效果，并且一定剂量范围内的炙马钱子免疫调节作用更优于强的松。

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The Immune Regulation Mechanism of Nux Vomica on Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis Rats

ZOU Ying1,QIU Tao2,YANG Feng3. 1.Department of Clinical Psychology,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310005）,China;2.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University;3.Zhejiang Chinese Medical University

Objective To investigate the immune regulation mechanism of nux vomica on experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG）rats.Methods Lewis rats were immunized with torpedo-derived 97-116 peptide of the AchRα-subunit in CFA.After the second immunization,the rats'weights and symptoms were observed to judge the success of the EAMG model.Rats with EAMG were divided into model group,prednisone group,nux vomica groups（low-,medium-,and high-dosage）,8 rats in each group,and were given the corresponding treatment,respectively.The levels of AchRab and IL-6 were determined by using enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results The level of AChRab and IL-6 were increased in model group（all P＜0.01）.The level of AChRab in high-dose nux vomica group was lower than that in medium-and low-dosage nux vomica groups（P＜0.01）,but was not different with that in prednisone group（P＞0.05）.The level of IL-6 in medium-and highdosage nux vomica groups was significantly lower than that in prednisone group（all P＜0.01）,but there was no significant difference between high-and medium-dosage nux vomica groups（P＞0.05）.Conclusion Nux vomica can reduce the level of AChRab and IL-6 in EAMG model,inhibit the activation of T cells and B cells,so that it can reduce the damage of postsynaptic membrane AchR,and alleviate the development of EAMG.The effect of nux vomica is better than prednisone in improving immune adjustment in a certain dosage range.

rats；autoimmune myasthenia gravis；AChRab；IL-6；nux vomica；prednisone

2014-06-04

修回日期：2014-07-11

浙江省中医药科技计划项目（No.2011ZA033）；浙江省中医药科技计划项目（No.2012ZB050）

裘涛，E-mail：qiutao2002002@163.com