参附强心合剂对心衰大鼠水通道蛋白2水平的影响

周 凡 方 伟 祝光礼 赫小龙 浙江中医药大学附属广兴医院心血管科 杭州 310007

参附强心合剂对心衰大鼠水通道蛋白2水平的影响

周 凡 方 伟 祝光礼 赫小龙 浙江中医药大学附属广兴医院心血管科 杭州 310007

目的 观察参附强心合剂对心衰大鼠心功能及水通道蛋白2（AQP-2）水平的影响，探讨参附强心合剂抗心衰水潴留的作用机制。方法 用腹主动脉缩窄法制作心衰大鼠模型，造模成功60只大鼠随机分为参附强心合剂大、中、小剂量组，氯沙坦组和模型组，每组12只。前三组分别按成人用药剂量20、10、5倍的参附强心合剂14g/（kg·d）、7g/（kg·d）、3.5g/（kg·d）灌胃；氯沙坦组以成人剂量10倍的氯沙坦10mg/（kg·d）灌胃；模型组以蒸馏水灌胃。另假手术组大鼠12只以蒸馏水灌胃作为空白对照组。给药4周后，心超检查测定左室射血分数（LVEF），ELISA法检测大鼠尿AQP-2浓度，Western blot检测大鼠肾脏AQP-2表达水平。结果 参附强心合剂可改善心衰大鼠心功能，其各剂量组大鼠尿AQP-2浓度及肾脏AQP-2表达水平均明显下降（P＜0.01或P＜0.05）；随参附强心合剂剂量的增加，AQP-2浓度逐渐下降，EF值逐渐升高；EF值与AQP-2间有良好的线性负性相关关系（P＜0.01）。结论 参附强心合剂可有效改善心衰大鼠心功能，降低AQP-2浓度，且呈一定的剂量依赖性；其作用机制与降低心衰大鼠AQP-2浓度有关。

大鼠；心衰；水潴留；水通道蛋白2；参附强心合剂

心力衰竭（心衰）是一种复杂的临床症状群，是各种心脏病发展的严重阶段，发病率高，5年存活率与恶性肿瘤相仿。我们前期研究证实，参附强心合剂能降低患者循环肾素、PRA、AngⅡ、E、NE水平，抑制心衰时肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的过度激活，改善心衰患者临床症状。本研究通过腹主动脉缩窄法制备大鼠心力衰竭模型，观察参附强心合剂对心衰大鼠心功能及其AQP-2的影响，探讨其对心衰水潴留机制的调节作用，以期进一步阐释该方治疗心力衰竭的机制，为中医药治疗心衰提供新思路。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠72只，体质量130～160g，无人畜共患疾病，由浙江省实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（浙）2008-0033。分笼饲养，保持室内环境恒温（19±3）℃，湿度在50%～60%，通风良好，标准饲料，自由进食饮水，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 主要药物及试剂 氯沙坦钾片（100mg/片，杭州默沙东制药有限公司，批号H20100361）；参附强心合剂（红参3g，附子5g，葶苈子10g，玉竹15g，将各药加水煎煮，首煎1.5h，二煎0.5h。浓缩成2g/mL的生药煎剂。由杭州市中医院制剂室提供）；大鼠水通道蛋白2（AQP-2）酶联免疫检测试剂盒（R&D公司，批号RT201106121）；大鼠水通道蛋白2（AQP-2）for Western blot（美国Cell signal公司，批号46098）；BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，批号22610240）。

2 实验方法

2.1 造 模 72只SD大鼠随机取12只作为假手术组，其余为手术组。大鼠腹主动脉缩窄心衰模型的制作参照参考文献[1-3]并略作改进。假手术组开腹后仅分离腹主动脉而不行缩窄术。所有大鼠均进行标准饲料常规喂养，于术后4周，取12只手术大鼠及假手术组大鼠行超声心动图检查，记录左室舒张末内径（LVEDD）、左室短轴缩短率（FS）和左室射血分数（LVEF）。若手术大鼠心功能较假手术组明显下降提示造模成功。

2.2 分组及给药 造模成功大鼠60只按随机数字表法分为参附强心合剂大、中、小剂量组，氯沙坦组和模型组，每组12只。前三组分别按成人用药剂量20、10、5倍剂量的参附强心合剂以14g/（kg·d）、7g/（kg·d）、3.5g/（kg·d）灌胃；氯沙坦组以成人剂量10倍的氯沙坦10mg/（kg·d）灌胃；模型组以蒸馏水灌胃。另假手术组大鼠以蒸馏水灌胃作为空白对照组。给药时间4周。

2.3 大鼠心超检查 给药4周后，对各组大鼠行超声心动图检查，测量并记录左室舒张末内径（LVEDD）、左室短轴缩短率（FS）和左室射血分数（LVEF）。

2.4 各组大鼠尿液AQP-2测定 采用双抗体夹心ELISA法。末次给药24h后，留取大鼠末次尿液标本，于4℃下3000r/min离心15min，吸取上清液，分别加100μL标准品和待测样品于相应反应孔中，置37℃恒温水浴箱反应120min，洗板后加酶标抗体工作液，将反应板置37℃恒温水浴箱反应60min，再洗板，加入底物工作液显色后终止，所得OD值减去空白值后为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度，测定大鼠尿液AQP-2含量。

2.5 各组大鼠肾脏AQP-2蛋白表达测定 末次给药24h后处死大鼠取肾脏标本，称取100mg肾脏组织，液氮研磨成粉，放入EP管中，加入500μL细胞裂解液，冰浴30min，每5min EP管剧烈震荡15s，然后4℃12 000g，离心25min，取上清，BCA法求得各样本蛋白浓度。每组取50μg样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳后半干式转膜，加入相应一抗4℃孵育过夜，继加入二抗置于水平摇床上3档慢速孕育，室温1.5h，后洗涤3次，ECL显影，胶片扫描后，Image J软件进行图像分析，以β-actin作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。

3 实验结果

3.1 各组大鼠心功能比较 给药4周后，大鼠心超检查提示，与模型组比较，参附强心合剂各剂量组及氯沙坦组LVEDD均有下降（P＜0.05）、FS、EF均有上升（P＜0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠FS、EF值明显下降，LVEDD值明显升高（P＜0.05），证实造模成功。参附强心合剂大剂量组和氯沙坦组LVEDD、FS、EF值与假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），参附强心合剂大剂量组EF与氯沙坦组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。参附强心合剂各剂量组间两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05），但存在FS、EF值随参附强心合剂剂量的提高而升高，LVEDD值随参附强心合剂剂量的提高而降低的趋势，说明参附强心合剂改善心功能的作用存在一定的剂量依赖性，见表1。

3.2 各组大鼠尿液AQP-2浓度比较 与模型组比较，参附强心合剂各剂量组、氯沙坦组尿液AQP-2浓度均明显下降（P＜0.01）；与假手术组比较，参附强心合剂大剂量组和氯沙坦组差异无统计学意义（P＞0.05），氯沙坦组与参附强心合剂大剂量组比较尿液AQP-2浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。参附强心合剂大、中剂量组尿液AQP-2浓度显著低于小剂量组（P＜0.01），见表2。

表1 各组大鼠心功能比较（±s）

表1 各组大鼠心功能比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，▽P＜0.05

组别参附强心合剂大剂量组参附强心合剂中剂量组参附强心合剂小剂量组氯沙坦组模型组假手术组n/只12 12 12 12 12 12 LVEDD/mm 6.02±0.41* 6.26±0.52* 6.38±0.41*▽5.93±0.46* 6.85±0.53▽5.82±0.32** FS/% 38.40±7.73* 36.64±5.88*▽35.50±5.77*▽40.53±5.94* 27.53±5.17▽43.65±6.32** LVEF/% 73.99±7.40* 68.11±6.05*▽65.18±6.82*▽76.64±6.26* 57.30±8.29▽80.86±5.97*

表2 各组大鼠尿液AQP-2浓度比较（±s）

表2 各组大鼠尿液AQP-2浓度比较（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01；与参附强心合剂小剂量组比较，▲▲P＜0.01

组别参附强心合剂大剂量组参附强心合剂中剂量组参附强心合剂小剂量组氯沙坦组模型组假手术组n/只666666 AQP-2（ng/mL）4.972±0.356**▲▲5.430±0.408**▽▽▲▲6.896±0.495**▽▽4.894±0.281** 8.380±0.310▽▽4.527±0.323**

3.3 EF值与AQP-2浓度相关性分析 模型组EF值较参附强心合剂各剂量组、氯沙坦组及假手术组均明显下降，尿AQP-2值较参附强心合剂各剂量组、氯沙坦组及假手术组均明显升高。用药4周后，参附强心合剂各剂量组、氯沙坦组及假手术组EF值较模型组均改善，其升高程度与尿AQP-2下降程度呈线性负性相关关系（P＜0.01），见图1。

图1 大鼠EF值与尿AQP-2相关性（r=0.95，P＜0.01）

3.4 各组大鼠肾脏AQP-2蛋白表达量比较 与模型组比较，参附强心合剂各剂量组、氯沙坦组、假手术组肾脏组织AQP-2表达均明显下降（P＜0.01）；与氯沙坦组比较，参附强心合剂大剂量组AQP-2蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；参附强心合剂各剂量组间两两比较，参附强心合剂大剂量组AQP-2蛋白表达水平显著低于中、小剂量组（P＜0.01），且存在AQP-2蛋白表达水平随参附强心合剂剂量增加而降低的趋势，说明参附强心合剂下调AQP-2蛋白表达水平的作用存在剂量依赖性。见表3，图2。

表3 各组大鼠肾脏组织AQP-2蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠肾脏组织AQP-2蛋白表达比较（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01；与假手术组比较，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01；与参附强心合剂大剂量组比较，☆☆P＜0.01

组 别n/只AQP-2/β-actin参附强心合剂大剂量组参附强心合剂中剂量组参附强心合剂小剂量组氯沙坦组模型组假手术组666666 0.066±0.004**▽0.195±0.019**▽▽☆☆0.225±0.018**▽▽☆☆0.064±0.007**▽1.399±0.306▽▽0.050±0.009**

图2 各组大鼠肾脏组织AQP-2蛋白表达1～6组别依次为：参附合剂大剂量组、中剂量组、小剂量组、氯沙坦组、假手术组、模型组。

4 讨论

水钠潴留是充血性心力衰竭（CHF）最重要的病理生理改变之一，也是心源性水肿的最主要发病机制，同时还是充血性心力衰竭出现症状的重要原因，并可导致心脏功能的进一步受损。中医认为，阳气具有温化水液的作用，肾主水，肾阳在水液代谢过程中起着极其重要的作用，故有肾为水脏之说。生理状态下的心阳肾阳相温相助，心阴肾阴相滋相煦，从而达到心肾相交、水火互济的协调生理状态，在病理状态下心肾两脏也相互制约，相互影响，从而心病及肾，肾病及心，最终导致心肾俱病。研究[4]认为心衰以水湿为病，强调利水渗湿是主要环节，提出温阳化气，调畅气血，通利三焦，宣气利水等清利水湿4法，分别治疗肾虚不主气化，水液不行；阳虚水泛，水气凌心；肝郁气滞，水痕交浊；湿浊弥漫三焦；湿邪遏阻气机，表里皆有湿停或内有水湿，兼有表气不通之证。现代医学认为，水通道蛋白2（AQP-2）是与心衰过程中水潴留密切相关的主要体液因子之一。研究证实，AQP-2是机体内调节水重吸收作用的关键性靶蛋白，是充血性心力衰竭水潴留机制中最重要的效应因子。迄今为止，已在哺乳动物体内发现13种水通道蛋白（AQP0～AQP12），AQP-2是其中的重要成员之一，是由Fushimi1993年克隆确认的水通道蛋白家族中的一种[5]。AQP-2在肾中大量分布，主要位于肾脏集合管（CD）主细胞管腔侧和靠近管腔侧的囊泡内，是血管加压素（AVP）依赖性水通道，也是调节肾脏集合管对水通透性的关键蛋白，在调节肾脏水平衡中起重要作用，被认为是维持人体内水平衡的必须物质[6]。CHF时水潴留机制的主要途径为：心输出量下降→血中AVP增加→肾集合管主细胞V2受体激活→AQP-2激活/或基因表达上调→水重吸收增加→水潴留[7]。因此，CHF过程中的体液因子会随着CHF的进展而发生进行性改变，且在一定程度上可以反映CHF的严重程度。这与中医对于心衰的病机和诊治的认识存在着一致性。

参附强心合剂由历史名方参附汤加葶苈子、玉竹而来。参附汤源于《妇人良方》，功能回阳救逆、益气固脱；葶苈子平喘利水，使肺气清肃，水道通调；玉竹滋养心阴，又能牵制附子助阳太过。诸药合用，共奏益气温阳利水之功，并兼顾心阴。本研究结果显示，参附强心合剂明显改善慢性心衰模型大鼠心功能，表现为左室舒张末内径（LVEDD）下降，左室短轴缩短率（FS）及左室射血分数（EF）升高（P＜0.05），且两者之间存在一定的剂量依赖性，而参附强心合剂大剂量改善心功能的作用与氯沙坦相当。结果进一步表明，参附强心合剂大、中、小剂量组均可以降低心衰大鼠AQP-2浓度，并呈一定的剂量依赖性，其中大剂量组效果优于中、小剂量组（P＜0.01）；参附强心合剂大剂量降低AQP-2浓度的作用与氯沙坦相当。

本研究显示，参附强心合剂可改善心衰大鼠心功能，其作用机制之一可能通过下调肾脏管腔膜上的AQP-2，使水通道关闭，通透性下降，水重吸收减少，尿量增多，尿液稀释，尿液中AQP-2相应减少，从而发挥抗心衰水潴留的作用。

［1］Doering CW，Jalil JE，Janicki JS，et al.Collagen network remodeling and diastolic stiffness of the rat left centricle with pressure overload hypertrophy［J］.Cardiovasc Res，1988，22（10）：686-95.

［2］胡咏梅，李法绮，罗羽慧，等.腹主动脉缩窄大鼠模型制作及临床意义［J］.重庆医科大学学报，2004，29（3）：322-324.

［3］杨涛，张伟，张雷.大鼠腹主动脉缩窄模型的制备及其效果的探讨［J］.中国老年学杂志，2009，29（1）：24-26.

［4］陈继红，王晓峰.中医药治疗充血性心力衰竭的临床研究进展［J］.新疆中医药，2005，23（1）：61-63.

［5］Fushimi K，Uchida S，Hara Y，et al.Cloning and expression of apical membrane water channel of rat kidney collecting tubule［J］.Nature，1993，361（6412）：549-552.

［6］李学军，于喝鸣.水通道的分子生物学研究［J］.生理学进展，1996，27（1）：19-24.

［7］欧阳助，陈琳.水通道蛋白2与心血管疾病［J］.心血管病学进展，2005，26（6）：620-623.

Effects of Shenfu Qiangxin Decoction on Concentration of Urinary Aquaporin 2 in Chronic Heart Failure Rats

ZHOU Fan,FANG Wei,ZHU Guang-li,HE Xiaolong. Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

Objective To investigate the effect of Shenfu qiangxin（SFQX）decoction on cardiac function and the level of urinary aquaporin 2 in chronic heart failure（CHF）rat model,in an attempt to explore the underlying mechanism of SFQX decoction on water retention in CHF.Methods Sixty CHF models in male adult SD rats were made by coarctation of abdominal aorta（CAA）and then were randomly divided into 5 groups:SFOX groups（large,medium,and low dose）,losarton group,and model group.Another 12 SD rats received sham operation. Large-,medium-,and low-dose SFQX groups were intragastically given 14,7 and 3.5 g·kg-1·d-1SFQX decoction, losarton group was given 10 mg·kg-1·d-1of losarton,and model group and sham group were grive 2 mL/d of sterile purified water.At the end of 4 weeks,the cardiac function was measured by ultrasonic echocardiogram,and AQP-2 was detected by ELISA and western blot.Results Comparing with model group,the cardiac function were improved in SFQX groups;the concentration of urinary AQP-2 and the expression of AQP-2 in renal tissue were reduced（P＜0.01 or P＜0.05）.The concentration of AQP-2 reduced but ejection fraction（EF）increased correspondingly with the increase of the dose of SFQX decoction.There was a remarkable negative correlation between EF and the concentration of urinary AQP-2（P＜0.01）.Conclusion SFQX decoction can improve the cardiac function and reduce the concentration of AQP-2 in CHF rat model in a dose-dependent manner.The mechanism of SFQX decoction on water retention in CHF rats may be related to reduce the concentration of AQP-2.

rats；heart failure；water retension；Aquaporin 2；Shenfu Qiangxin decoction

2014-05-24

修回日期：2014-07-14

浙江省中医药科技计划项目（No.2010ZA093）

周凡，Tel：13186988396，E-mail：ff.zhou@163.com