H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

李媛媛，郭 晶，李旭勇，王金良，范 俊，梁立滨，邓国华，施建忠，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒所引起的一种禽源性疾病，根据HA和NA的抗原差异可将禽流感病毒(AIV)分为17个H亚型和10个N亚型[1]。虽然家禽中感染H7N9亚型AIV已有报道，但2013年以前，并未发现其感染人的情况[2]。2013年3月，在上海、安徽两地出现急性呼吸道感染患者，后被证实为新型H7N9 AIV感染[3]，截止10月25日，出现人感染H7N9亚型AIV 137例，死亡45例，死亡率高达33%。这种新型流感病毒的遗传背景十分复杂，是一种多元重组病毒，其HA基因与H7N3具有很高的同源性，NA基因与H4N9、H7N9、H11N9均具有很高的同源性，其内部基因来源于H9N2[4-5]。这种对家禽呈现低致病力的病毒很容易在禽类中存在却因无症状而不被注意，但其对人却具有很高的致病力甚至死亡率[6]，因此建立H7N9亚型AIV反向遗传操作系统对该病毒致病机理和跨宿主传播机制的研究以及研制重组疫苗候选株至关重要。

本研究以H7N9亚型AIV CK/53为亲本病毒株，通过建立反向遗传操作系统，为今后对病毒表型的核酸水平因素的研究提供技术平台。构建的H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8，为进一步的免疫保护试验奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要实验材料 A/chicken/Shanghai/S1053/2013(CK/53)由本实验室分离和保存；PR8反向遗传操作系统由本实验室构建[7]；双向表达载体pBD、293T、MDCK、A549细胞由本实验室保存；10日龄SPF鸡胚由本研究所实验动物中心提供。病毒操作均在动物生物安全三级实验室完成。

1.2 主要试剂 反转录酶 M-MLV、RNaseOUT、LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司；BSPQI酶、Klenow大片段酶、Phusion高保真DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶均购自NEB公司；小量质粒抽提纯化试剂盒、胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自Omega公司；质粒中提试剂盒购自Qiagen公司。引物由上海英竣生物技术有限公司合成。

1.3 病毒基因的扩增 提取CK/53株病毒总RNA，按M-MLV试剂盒说明进行反转录，反转录引物序列为：5'-AGCAAAAGCAGG-3'。根据CK/53的各片段序列设计引物，每对引物在上游5'端增加2个碱基CC，在下游3'端增加2个碱基TT。以病毒反转录产物cDNA为模板进行8个基因片段的扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA胶回收试剂盒纯化回收。

1.4 重组质粒的构建 参照文献[7]中的方法将病毒各节段基因扩增的PCR产物克隆于pBD载体中，阳性重组质粒经中提后用于转染。

1.5 病毒和疫苗候选株的救获以及序列鉴定 按照LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒将CK/53的8个重组质粒0.5 μg混合，共转染293T细胞，48 h后将细胞液接种10日龄SPF鸡胚，0.4 mL/枚，37℃培养，48 h后取尿囊液进行血凝(HA)试验，收集HA结果呈阳性的鸡胚尿囊液分装后于-70℃保存备用。同时，提取救获病毒的RNA，扩增病毒基因组的8个节段，胶回收后测序，利用DNAStar软件比较救获病毒与亲本病毒核苷酸序列是否一致。

按上述方法，将来自CK/53的表面基因(pBDHA和pBD-NA)与来源PR8的6个内部基因共转染，救获重组疫苗株。

1.6 拯救病毒与疫苗候选株生长曲线测定 将拯救病毒以MOI=0.001感染MDCK和A549细胞，分别于12 h、24 h、48 h、72 h收取细胞上清液，并绘制病毒生长曲线。

2 结果与讨论

2.1 CK/53基因8重组质粒构建和病毒拯救及鉴定用针对CK/53的引物对病毒8节段基因进行扩增(图1)，并将CK/53的8个片段处理后分别与处理好的pBD载体连接，构建成8质粒双向表达重组质粒，对扩增产物进行测序鉴定与亲本病毒株一致。利用反向遗传操作技术拯救出rCK/53，在鸡胚繁殖一代后，血凝价达到28，提取RNA、反转录，扩增病毒的全基因组片段进行测序，测序结果与扩增产物无任何缺失或突变。

2.2 疫苗候选株的拯救及全基因组序列测定 用CK/53的含有HA、NA基因的重组质粒和来源于PR8的6个内部基因的重组质粒，8个片段拯救出候选疫苗株，扩增病毒的全基因组片段，测序结果与亲本病毒完全一致。

2.3 拯救病毒与疫苗候选株在MD CK和A 549细胞中的生长曲线 拯救病毒与候选疫苗株在MDCK中，48 h和72 h病毒复制差异明显；在A549中的复制速度基本相同(图2)。

2013年暴发的H7N9 AI对人类和家禽的养殖业造成了严重的危害，本研究采用反向遗传操作系统，以CK/53为亲本病毒，救获了rCK/53，为进一步开展H7N9流感病毒跨宿主传播机制和致病机理的研究奠定了基础；并且以PR8的内部基因为骨架，以CK/53的表面基因为供体，构建了H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8，为进一步的疫苗评估试验奠定了基础。

图1 AIV CK/538节段PCR扩增结果Fig.1 Amplifications of eight gene segments from AIV of CK/53 by PCR

图2 拯救病毒与疫苗候选株在MDCK和A549细胞中的生长曲线Fig.2 The cell growth curve in MDCK and A549 of the rCK53 and CK53/PR8

[1]Zhu Xue-yong,Yu Wen-li,McBride R,et al.Hemagglutinin homologue from H17N10 bat influenza virus exhibits divergent receptor-binding and pH-dependent fusion activities[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(4):1458-1463.

[2]朱闻斐，高荣保，王大燕，等.H7亚型禽流感病毒概述[J].病毒学报，2013，29(003)：245-249.

[3]Gao Rong-bao,Cao Bin,Hu Yun-wen et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus[J].N Engl J Med,2013,368(20):1888-1897.

[4]Shi Jian-zhong,Deng Guo-hua,Liu Pei-hong,et al.Isolation and characterization of H7N9 viruses from live poultry markets-Implication of the source of current H7N9 infection in humans[J].Chin Sci Bull,2013,58(16):1-7.

[5]Zhang Qian-yi,Shi Jian-zhong,Deng Guo-hua,et al.H7N9 influenza viruses are transmissible in ferrets by respiratory droplet[J].Science,2013,341(6144):410-414.

[6]Wen Yu-Mei,Klenk H D.H7N9 avian influenza virus-search and re-search[J].Emerg Microbes Infect,2013,2(5):e26.

[7]范俊，李旭勇，王金良，等.7.2分支H5N1亚型禽流感病毒反向遗传疫苗候选株的构建[J].中国预防兽医学报，2013，35(9)：764-766.