2011年～2012年四川地区J亚型禽白血病分子流行病学调查

余松城，任 雅，牛 婷，夏 静，吴瑞婷，杨晓林，易 林，邹年莉，黄 勇*

(1.四川农业大学动物医学院，四川 雅安 625014；2.四川省雅安市天全县农业局，四川 雅安 625500)

禽白血病(Avian leukosis，AL)主要由反转录病毒科禽甲型反转录病毒属的AL病毒(ALV)及禽肉瘤病毒(RSV)等引起，以造成禽类造血组织中某些细胞成分过度增生的多种肿瘤性疾病为主[1]。自1998年以来，J亚群ALV(ALV-J)的出现给养禽业造成了严重的损失[2]。

J亚群AL在我国已广泛存在，近几年该病的流行日趋严重，由于ALV-J具有广泛的宿主嗜性，目前我国黄羽鸡、麻鸡、白羽肉鸡、海兰褐等多个品系发生ALV-J的感染[3-4]。自2011年初以来，四川地区疑似鸡J亚群AL病例频发，各鸡种均有发病，鸡群ALV的感染率较高，病死率也相对较高。为了解近年来ALV-J的流行情况和病毒分子特征，我们从多个鸡场采集样品并进行检测，初步分析了ALV-Jgp85基因的分子特性。

1 材料和方法

1.1 病料样品来源 2011年10月至2012年10月分别在四川部分地区的8个鸡场采集疑似AL鸡的700份血液样本和84份组织样本，采样鸡品种主要为三黄鸡、白羽鸡、藏鸡、绿壳蛋鸡、草科鸡。

1.2 主要试剂 DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T载体及TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

1.3 引物设计与合成 参照文献[5]方法设计用于检测ALV-J的引物，JF：5'-GGATGAGGTGACTAA GAAAG-3'，JR：5'-CGAACCAAAGGTAACACACG-3'，其扩增产物预期为545 bp。根据GenBank中登录的HPRS103(Z46390.1)的基因序列设计扩增gp85基因引物，GP85-F：5'-GTGCGTGGTTATTATTTCCG-3'，GP85-R： 5'-CGGGCTGTCACACTCCATAG-3'，其扩增产物预期为924 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 样品的PCR检测 将采集的样品经蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提方法提取样品中ALV-J的前病毒基因组DNA，以其为模板采用检测引物JF/JR进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 gp85基因的克隆和测序[6]对ALV-J检测为阳性的样品采用GP85-F/GP85-R引物进行扩增，纯化回收目的片段，克隆于pMD19-T载体中，阳性重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将gp85基因测序结果利用DNAStar软件进行分析，并与国内外23个参考病毒株的相应核苷酸和氨基酸序列进行相似性分析,采用Clustal X和MEGA 3.1软件进行遗传进化树分析。

2 结果与分析

2.1 样品检测结果 疑似AL病鸡主要表现为生长缓慢，精神沉郁，蛋鸡产蛋率不高，有个别鸡爪部肿大，解剖后多数可见肝脏和脾脏肿大，有些在肝脏或脾脏有白色肿瘤，严重者肠系膜也出现肿瘤。各鸡场病料样品PCR检测结果表明：血液样品和组织样品ALV-J检出率分别为3.1%(22/700)和14.3%(12/84)。8个鸡场全部检测出ALV-J(表1)。

表1 样品来源及检测结果Table 1 Background of clinic samples and the ALV-J detection by PCR

本次调查显示，ALV-J感染在四川地区比较普遍，虽然组织和血液样本的检出率不高，但由于该病水平传播效率比其它亚群高，若不采取一定的防控措施，ALV-J的感染可在鸡群中扩大，使防控难度进一步加大。

2.2 gp85基因测序结果分析 选取18个ALV-J阳性样品测定gp85基因序列，与其它23个国内外参考病毒株的相应序列进行比对分析。结果表明所测样品gp85基因核苷酸序列同源性为87.7%～99.8%，氨基酸同源性为86.4%～99.2%；与J亚群原型病毒株HPRS-103的核苷酸同源性为87.3%～98.2%，氨基酸同源性为86.7%～97.2%；与其他J亚群分离株的核苷酸序列同源性为85.7%～97.1%，氨基酸同源性为84.5%～96.8%(图1)。以HPRS-103为参考株，比对的氨基酸序列显示7个氨基酸的高频变异点，为第54、66、67、175、204、209和 246位氨基酸。此外，有些独特的突变位点在采自四川的大部分测序样品中呈现特征性的规律，分别位于第209位和246位。在18个测序样品中，E209K/N点突变占83.33%(15/18)，其中突变为K的有12个，突变为N的有3个；E246K/N/A点突变占88.9%(16/18)，其中突变为K的有12个、N的有3个及A的有1个。这些特征或可以作为四川地区ALV流行株的特征之一，生物学意义还有待于进一步研究。

图1 gp85基因核苷酸序列进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree based ongp85gene sequences of ALV-J

基于gp85基因的氨基酸序列构建的遗传进化树表明，四川部分地区18个样品中测得的病毒序列主要分属4类(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅵ)(图1)。其中Ⅰ类分支样品有11个，表明早期的病毒株仍在流行，并且占的比列较高(61.1%)。与美国分离株US4817处于同一分支的样品有1个。Ⅲ类分支的样品有5个，表明四川地区的病毒株仍在流行并且发生了变异。样本SM虽然与其它样本处于不同的分支，但它和美国分离株US7501处于同一分支。因此，四川地区近年来的流行株与国外的分离株有直接的联系，这些样本对应的病毒株的来源可能还是从国外引种。同一地区的样品的遗传进化也不同，如SM-1、SM-4和SM均来自石棉县，但3者处于两个不同的遗传分支，出现这种情况与该地区的不同养殖场的鸡苗的来源不同有关。但有的地方如乡城的样本序列均处于同一分支，据调查该地方出于藏鸡保种的需要，没有引进外来血缘的鸡种，样品之间gp85基因变异较小。总之，2011年～2012年四川地区ALV-J的gp85基因存在明显的遗传多样性，这些序列均与国外病毒株有关，但在没有外来鸡种引入的地区如乡城县，样品之间的遗传变异很小。为了减少ALV-J的变异速度、减少不同遗传背景的ALV-J的混合感染及其由此带来的致病性的改变，各祖代鸡场要重视ALV-J的防控，特别是在育种过程中引入新的血缘时一定要先做好净化工作[7]。

[1]Payne L N,Nair V.The long view:40 years of avian leukosis research[J].Avian Pathol,2012,41(1):11-19.

[2]Payne L N.HPRS-103:A retrovirus strikes back.The emergence of subgroup J avian leucosis virus[J].Avian Pathol,1998,27(1):36-45.

[3]Sun Shu-hong,Cui Zhi-zhong.Epidemiological and pathological studies of subgroup J avian leukosis virus infections in inese local"yellow"chickens[J].Avian Pathol,2007,36(3):221-226.

[4]Cheng Zi-qiang,Liu Jian-zhu.Tumors Associated with Avian Leukosis Virus Subgroup J in Layer Hens during 2007 to 2009 in China[J].Avian Pathol,2010,72(8):1027-1033.

[5]Smith L M,Brown S R.Development and application of polymerase chain reaction(PCR)test s for thedetection of subgroup J avian leucosis virus[J].Virus Res,1998,54(1):87-98.

[6]Pan Wei,Gao Yu-long,Qin Li-ting,et al.Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein GP85 of ALV-J isolates from Mainland China between 1999 and 2010:Coexistence of two extremely different subgroups in layers[J].Vet Microbiol,2012,156(1-2):205-212.

[7]高玉龙，邵华斌，王笑梅，等.2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查[J].中国预防兽医学报，2010，32(1)：32-35.