利用Flesar SQ MS与AxION DSA/ TOF技术对杀菌剂进行快速筛查及定量分析

噻苯咪唑和烯菌灵是两种最常使用的水果采摘后表面杀菌剂，以防止柑橘、葡萄和柠檬等水果在采摘后由于霉菌而导致的腐烂。这些物质在较高剂量的时候是有毒的，会导致肝、肠功能的紊乱，且有致癌作用。在美国和欧洲，烯菌灵和噻苯咪唑在普通水果中的MRL（最大残留限量）分别是10ppm和5ppm。此类杀菌剂在有机类水果中是禁止使用的。因此需要在水果食用前，对这两种杀菌剂进行监测，检测控制此类化合物在普通水果中的最大残留限量及可能产生的毒副作用，以确保食品安全。已有文献报道，水果中的该类杀菌剂可通过各种不同的样品制备方法，如液液萃取和QUECHERS，与LC/MS技术相结合来进行测定。

该类方法主要的缺点在于，在方法开发、样品制备和分析过程中消耗了大量的时间和金钱。本应用文献中，建立了AxION直接样品分析系统和AxION飞行时间（TOF）质谱仪联用的分析方法，该方法可用于普通和有机水果样品中杀菌剂的快速筛查，且仅需很少的样品制备。在最初的样品筛查后，仅那些被检测出杀菌剂的水果样品需要使用FlexarTM FX-10与Flexar SQ 300 MS（LC/SQ）联用仪进行后续的定量分析，所使用的离子源为UltrasprayTM ESI。本工作展示了一种改进的富有成效的工作流程，首先采用DSA/ TOF进行样品的快速筛查，每个样品的筛查仅需10秒钟，筛查结果为阳性的样品才进行后续的LC/SQ分析。这样就减少了需要使用色谱分析的样品数量，从而减少了样品分析的总时间，降低了实验室溶剂使用量及制备成本。

方法

样品制备

从当地的市场上购买五种普通水果和两种有机水果样品。将这些样品的皮剥下，称取水果皮10g，使用30mL的乙腈萃取。萃取完成后，用滴管取5uL萃取液于不锈钢的样品靶板上，用DSA/TOF进行快速筛查分析。然后，在LC/MS分析前，使用QUECHERS方法对样品的乙腈萃取液进行净化处理。移取1.5mL的ACN萃取液置于含有25mgPSA吸附剂和150mgMgSO4的离心管中，7800rpm离心10min。离心后，取0.6mL上层溶液氮吹干燥30min，使用35/65的甲醇/水溶液将样品复溶至0.6mL，用于LC/MS分析。

DSA/TOF参数

分别取5uL的乙腈萃取的样品溶液滴于不锈钢靶板上，用AxION DSA体系进行离子化及分析。DSA/TOF的试验参数如下：电晕电流为5uA，加热器温度为300℃。AxION2 TOF MS使用正离子模式采集数据，飞行电压为-8000V。毛细管出口电压设置为100V。质谱采集质量范围m/z为：100～700，采集速率为5spectra/s。所有样品均在10s内完成分析。为了获得高质量精度，AxION 2 TOF在运行每个样品前，使用流动注射的方式以10uL/min的流速注入校准溶液进行校准。

LC/SQ质谱参数

在DSA/TOF快速筛查后，对那些可能存在杀菌剂的样品采用LC/SQ MS进行后续分析。杀菌剂使用PerkinElmer BrownleeTM Supra C18色谱柱（2.1x100 mm， 3μm）进行分离，流速为0.5mL/min，线性梯度为，在5min内由35%甲醇水溶液至95%甲醇水溶液（含0.05%乙酸），色谱柱的温度为30℃，进样体积为3μL。ESI离子源的温度和干燥气的流速分别为350℃和15mL/min。SIM的驻留时间为100ms。通过LC/ MS监测噻苯咪唑和烯菌灵两种杀菌剂的分子离子及碎片离子以进一步确证其在水果中的存在与否。检测噻苯咪唑分子离子和碎片离子的最佳毛细管出口电压分别为90和160V。检测烯菌灵的分子离子和碎片离子最佳毛细管出口电压分别为80和140V。

结果

杀菌剂的DSA/TOF快速筛查

两个有机水果样品和五个普通水果样品中噻苯咪唑和烯菌灵的提取离子色谱图（EIC）数据显示，五个普通水果样品中都含有噻苯咪唑，而烯菌灵仅存在于其中的三个普通水果样品中。由于有机水果被禁止使用杀菌剂，该类样品中不应该含有杀菌剂。DSA/TOF快速筛查结果显示，潜在的杀菌剂果需要采用LC/SQ MS进行进一步的定量分析。有机水果样品中含有的杀菌剂要比普通水果样品含量低。放大的EIC数据显示有机葡萄样品中不含有这两种杀菌剂。使用质量准确度低于5ppm的DSA/TOF法进一步确证柑橘类水果样品中杀菌剂的存在。DSA/ TOF分析结果显示，所有的普通水果样品中都存在一种或两种杀菌剂，而有机水果样品中仅一半样品含有此两种杀菌剂。本应用文献显示，DSA/TOF可用于水果中杀菌剂的快速筛查，进而利用LC/SQ进行定量分析。

LC/SQ定量分析杀菌剂

色谱分离噻苯咪唑和烯菌灵的检测限分别为0.3和0.45ppb。数据显示，两种杀菌剂的线性范围为1～1000ppb，相关系数R2优于0.9933。两种杀菌剂在水果中的存在情况通过源CID（碰撞诱导解离）技术监测高毛细管电压下的碎片离子，及其与标准品保留时间的匹配情况得到进一步确证。表1是五种普通水果样品及一种有机水果样品中测定的杀菌剂含量。结果显示，五种普通水果中杀菌剂的含量都低于5ppm的最大残留限量值。同样，也确证了一种有机水果样品中含有低浓度的杀菌剂，与DSA/ TOF初筛结果一致。

结论

该应用文献首次采用DSA/TOF技术对普通水果和有机水果中的杀菌剂进行快速筛查，每个样品均在10s内分析完成。结果显示，在五种普通的水果样品中均含有杀菌剂，一种有机水果样品中也含有杀菌剂。通过外标校准所有DSA/ TOF检测的质量精度都小于5ppm。在最少的样品制备下，每个样品都在10s内完成快速筛查。快速筛查后，含有杀菌剂的样品进一步使用LC/SQ MS进行定量分析。所建立的LC/MS方法定量测定水果样品中的杀菌剂分析时间小于5min。噻苯咪唑和烯菌灵均通过分子离子和碎片离子的SIM扫描监测模式来确证其在水果样品中的存在情况。所有检测的普通水果样品中杀菌剂的含量在0.5～1.5ppm之间，低于5ppm的最大残留限量值。有机葡萄样品中不含有杀菌剂，然而有机柑橘样品中含有杀菌剂，其含量约为0.02ppm。

根据该应用文献，样品可以采用DSA/TOF进行快速筛查，可分成阳性和阴性两类。初筛后，仅有阳性样品需要采用LC/MS进行的定量分析。与其它使用如LC/MS和GC/MS建立的分析方法相比，本方法使用DSA/TOF与LC/MS联用，减少了分析时间，减少了溶剂的消耗，从而降低了实验室分析成本，提高了分析效率。endprint