白鲜皮水提物对ApoE-／-小鼠动脉粥样硬化晚期病变形成的影响

王丽丽，吕新勇，李 琳，李志强，，李彦林，萧 伟，许 扬

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏连云港 222002）

白鲜皮为芸香科植物白鲜（Dictamnus dascarpus Turcz）的干燥根皮。因其具有清热燥湿、祛风解毒的功效，在传统中药学上归为清热燥湿类。临床主要用于皮肤病如湿热疮毒、皮肤瘙痒、湿疹、风疹、疥癣、疮癞、风湿热痹、黄疸尿赤等的治疗［1］，但其在心血管疾病中是否具有治疗作用的研究甚少。笔者［2］的前期研究中，发现白鲜皮水提物（cortex dictamni aqueous extract，CDAE）可明显抑制载脂蛋白E基因缺损（ApoE-／-）小鼠早期动脉粥样硬化病变的形成，显示了白鲜皮对于干预心血管疾病具有初步作用。在此基础上，笔者进一步研究了CDAE对ApoE-／-晚期动脉粥样硬化的影响，并探讨了相关的作用机制。

1 材料

1.1 实验材料

1.1.1 动物 ApoE-／-小鼠，♀，6周龄，体质量 15～16 g。购于北京大学医学部实验动物中心［SCXK（京）2006－0008］。饲养于中国医学科学院药用植物研究所 SPF级动物房内［SCXK（京）2008－0019］。20℃，12 h昼夜交替。

1.1.2 药材 白鲜皮（分别购于河北安国药材市场及北京仟草中药饮片有限公司，产地辽宁，由本研究所邹忠梅教授鉴定，样品保存号：NO.010001850001）生药100 g。利用2 L蒸馏水4℃冷浸24 h，超声波提取25 min过滤，再重复2次加入2 L蒸馏水超声波提取25 min过滤，合并提取液，于旋转蒸发仪上80℃浓缩至100 ml，即得含生药量1 000 g·L－1的白鲜皮水提物。

1.1.3 仪器 上海亚荣RE52AA旋转蒸发仪，日立7060全自动生化分析仪，美国Beckman XL-90超速离心机，美国Beckman Coulter离心管切割机，美国Hamilton MicroLab 500稀释器，德国Leica 1900冰冻切片机，德国Leica DM4000M正置显微镜，美国Bio-Tek酶标仪，上海仪器有限公司UV-2102C／PC／PCS型分光光度计。

1.1.4 试剂 血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）试剂盒（中生北控生物科技股份有公司，北京），油红 O染料（Sigma，USA），PBS（中杉金桥生物技术有限公司，北京），OCT包埋剂（日本樱花精机株式会社，东京），胶原蛋白酶Ⅰ、胰蛋白酶（Sigma，USA）。HPLC检测所用标准品为白鲜碱（批号：111654－200301）、黄柏酮（批号：111923－201102）、梣酮（批号：111700－200602）（中国食品药品检定研究院，北京）。

2 方法

2．1 HPLC分析 色谱条件为：Waters色谱仪，色谱分析柱Thermo Synronis aQDim C18柱（5μm，250 mm×4.6 mm），流动相为甲醇 ∶水（60∶40，V／V），流速为1 ml·min－1，检测波长为236 nm，进样量为20μl，柱温设置为30℃（Fig 1）。

Fig 1 CDAE analyzed by HPLC

2.2 动物分组 60只6周龄的ApoE-／-♀小鼠，所有小鼠均以高脂饲科（含0.3%胆固醇，20%脂肪，其余成分与普通饲料相同，购于中国医学科学院动物研究所）喂养，自由摄食和饮水。喂养高脂饲料至12周，测定各组小鼠的血脂4项，对TC高于10 mmol·L－1的小鼠作为研究对象，随机分成 CDAE高、中、低剂量组和对照组4组，每组10只。

2.3 给药方法 CDAE 1000 g·L－1分别稀释成高、中、低3个浓度，每组按每只每天3.2、1.6、0.8 g·kg－1剂量灌胃，空白对照组按相同剂量给予稀释药物用的灭菌纯净水。每两周称重1次，调整给药量，连续给药6周（Fig 2）。

2.4 血脂测定 每组给药前后测定血脂各项指标，包括TC、TG、LDL-C、HDL-C。各组小鼠于给药前后禁食 12 h，眼眶取血，5 000 r·min－1离心10 min，分离上层血清，－80℃保存。实验结束后，用日立全自动生化仪一次全部测定完毕。

2.5 主动脉粥样硬化病变面积定量 各组给药结束后，小鼠经乙醚麻醉后开胸，以灭菌PBS液（0.01 mol·L－1，pH＝7.2）经心室灌流5 min后，分离主动脉根部和升主动脉，OCT包埋，制作厚6μm冰冻切片。从第1张血管腔及主动脉瓣可见处开始留取切片，每只鼠连续切80张。每5张抽取1张切片（共16张）作油红O染色，苏木精复染细胞核。组织切片在40倍显微镜下摄取图像，参照文献［3－4］的方法作病变面积定量分析，用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，USA）软件分析斑块面积，计算斑块面积占血管总面积之比。

Fig 2 Protocol for feeding and administration of CDAE

2.6 平滑肌细胞增殖和迁移的测定

2.6.1 原代平滑肌细胞的培养 大鼠胸主动脉平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的培养参照文献报道的方法［4］，取180～200 g♂ SD大鼠，脱臼处死后浸泡在75%酒精中消毒片刻，无菌条件下迅速取出胸主动脉，放入D-Hanks液中冲洗，去除血管周围结缔组织，刮除血管内膜，剥离出中膜，在青霉素小瓶中剪成约1 mm×1 mm碎块，加入0.25%胶原蛋白酶I，置入37℃摇床中，消化过夜。将消化好的组织块1 000 r·min－1离心10 min，倒去上清液，加入20%FCS的DMEM培养基，吹打混匀后，转入培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中静置培养，每3 d换液1次。选用4～6代的细胞，平滑肌细胞通过形态学及α-SM actin免疫组织化学方法鉴定。

2.6.2 VSMC增殖反应的测定 采用MTT法。取96孔细胞培养板，每孔加入0.1 ml含大鼠VSMC的培养液（细胞数 1.0×108·L－1），在 37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，换为含CDAE的培养液，使其终浓度为 12.5、6.25、3.125、1.56 g·L－1，继续培养至24、48、72 h，分别于每孔加入20μl MTT（5 g·L－1，PBS），继续孵育 4 h。弃上清，晾干后加入 100 μl DMSO，震荡15 min后用酶标仪检测（波长570 nm），按文献方法［5］计算抑制率。

2.6.3 VSMC迁移能力的测定 采用Transwell小室法［6－7］。在 Boyden小室中下层加入200μl含有趋化因子 PDGF-BB的 DMEM培养基，给药组为PDGF-BB加不同浓度的CDAE，阴性对照组为单纯DMEM培养基。VSMC经胰酶消化后计数，配制成1.0×108·L－1。将200μl细胞悬液加入 Boyden小室上层中，中间置以孔径8μm的聚碳酸酯膜，37℃孵育4 h后，吸弃多余培养液，使用棉棒仔细去除聚碳酸酯膜上的未迁移细胞，D-hanks液清洗2次，用无水乙醇固定10 min，苏木精染色10 min，蒸馏水冲洗。将滤膜置载玻片（下室面朝上），以中性树胶封片，在显微镜下（200×）随机计数5个视野中的细胞数，实验重复3次。

2.7 统计学分析 应用SPSS16.0软件，根据资料要求进行方差分析。

3 结果

3.1 给药前后对动物体重的影响 各组给药前后均称量体重，对照组、CDAE低、中、高剂量组的体重分别为（20.64±1.14）g、（21.04±0.95）g、（21.65±0.60）g、（21.38±1.40）g，经统计学处理各组间差异无显著性（P＞0.05），说明CDAE给药后对小鼠体重无明显影响。同时，对各组小鼠的摄食情况观察表明，对照组和3个给药组小鼠摄食和饮水均正常，活泼程度亦未见明显差异。

3.2 给药前后血脂各项指标的变化 实验结束后采集小鼠血液，离心分离血清，测定各组小鼠血清脂质水平（Tab 1）。结果表明，与对照组比较，3个给药组血清中TC、TG、LDL-C含量均有一定下降（Tab 1），TC值 CDAE中剂量组差异有显著性（P＜0.01），TG含量在CDAE低、中剂量组下降较明显（P＜0.01），LDL-C值 CDAE低、中、高剂量组均有明显下降（低、高剂量组，P＜0.05；中剂量组 P＜0.01），HDL-C值中剂量组差异有显著性（P＜0.01）。

3.3 给药后对动脉粥样硬化病变面积的影响ApoE-／-小鼠于6周龄开始给予高脂负荷饲料至18周龄，诱导晚期动脉粥样硬化病变的形成。从第12周龄起，分别给予低、中、高剂量的CDAE，空白对照组给予溶剂，至第18周时处死小鼠，取主动脉弓组织制作病理切片，计算病变面积比率。实验结果表明，CDAE低、中、高剂量组与空白对照组相比较，动脉粥样硬化斑块面积均见减少（Fig 3）。定量分析表明，CDAE低、中、高剂量组的病变面积比率分别（24.2±2.4）%、（20.1±2.9）%、（17.3±4.3）%，对照组为（25.8±3.7）%。经统计学处理，CDAE中、高剂量组病变面积与对照组比较差异有显著性（P＜0.05，P＜0.01），而低剂量组与对照组比较则无明显差异（P＞0.05）。

Fig 3 Cortex dictamni aqueous extracts inhibit advanced atherosclerosis in ApoE-deficient mice（n＝8）

3．4 CDAE对大鼠VSMC增殖影响 实验结果表明，与空白对照组比较，CDAE在给药浓度为12.5 g·L－1时，对VSMC的增殖呈现出明显的抑制作用，当CDAE浓度达50 g·L－1时，细胞的抑制率分别达到89%，97%和82%。可以看出，随着CDAE浓度的增高，对VSMC增殖的抑制作用不断增强（Tab 2）。

3.5 CDAE对大鼠VSMC迁移的影响 考察了在PDGF诱导下，大鼠VSMC平滑肌迁移的情况，设阴性对照组、PDGF诱导组和CDAE组进行观察。结果表明，PDGF能明显诱导平滑肌细胞的迁移，PDGF诱导组与阴性对照组比较，细胞迁移数从（25.6±6.3）个增加为（44.8±9.4）个，含 12.5 g·L－1CDAE培养基的细胞迁移数为（28.1±7.1）个。CDAE组与 PDGF诱导组间差异有显著性（P＜0.01），说明CDAE在体外条件下对平滑肌细胞迁移有明显的抑制作用。

Tab 1 Comparison of serum lipid contents in mice of 4 groups（¯x±s，n＝8）

Tab 2 Absorbing value of various groups

4 讨论

迄今的研究表明，白鲜皮具有明显的抗心肌缺血［8］、抗炎［9－10］、抑制免疫反应［11－12］的作用，这一系列的作用与动脉粥样硬化的发病机制具有密切的关 联 性［13］。 笔 者 前 期 研 究 表 明［2］，CDAE 对ApoE-／-小鼠早期动脉粥样硬化的形成具有明显的抑制作用。与其他干预动脉粥样硬化的药物不同的是，CDAE在抑制早期动脉粥样硬化病变形成的同时，对血脂水平并无明显的影响，而明显升高血清抗氧化酶的活性，并降低人血清LDL的氧化易感性。

本实验继续观察了CDAE对ApoE-／-小鼠晚期动脉粥样硬化病变的影响。实验结果表明，CDAE对晚期动脉粥样硬化斑块的形成同样具有较强的抑制作用，并具有量效关系。与CDAE干预ApoE-／-小鼠早期动脉粥样硬化病变形成机制不同的是，CDAE连续给药后，血脂水平明显下降，显示CDAE可通过降低血脂水平而抑制晚期动脉粥样硬化复杂病变的形成和发展。从给药后对血脂各成分的抑制效果分析，CDAE连续给药后，不仅对TC、TG、LDLC具有明显的降低作用，而且提升了HDL-C水平，促进了机体本身对于血中脂质的代谢和利用。本实验给药仍采用前期研究中的小鼠给药剂量（根据人用剂量换算），从抑制动脉粥样硬化斑块面积的效果上看体现了量效关系，但在降低血脂水平方面CDAE中剂量组效果非常明显（P＜0.01），而高剂量组效果仅LDL-C有明显下降，这与笔者在研究CDAE的长期毒性实验中，大剂量给药后肝脏ALT、Alkaline phosphatase指标有所上升具有一定的关联性（数据待发表），表明CDAE大剂量给药后可能对肝脏功能有所影响。

研究表明，在动脉粥样硬化晚期复杂病变形成机制中，血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移是病变过程中起着重要的作用因素。当血管受损时，血管中膜的VSMC发生表型转换，由合成型转变成收缩型，相对稳定的细胞开始增生，从中膜迁移到内膜，从而形成新生内膜和动脉粥样硬化斑块病变。而内膜损伤后，黏附、聚集的血小板释放的血小板衍生生长因子 （platelet derived growth factor，PDGF）已被确认与 VSMC增殖有关［14］。为了研究CDAE对晚期动脉粥样硬化的作用机制，我们分离了大鼠主动脉弓的平滑肌细胞，探讨了给药对大鼠VSMC增殖和迁移的影响。结果表明，CDAE不同剂量对VSMC的增殖有一定的抑制作用，在不同时间节点上，给药浓度和细胞生长的抑制率具有量效关系；同时，CDAE可以明显降低平滑肌细胞的迁移数量。表明CDAE可能直接阻断平滑肌细胞增殖和迁移的信号传导通路，从而减少ApoE-／-小鼠动脉粥样硬化晚期复杂病变的形成。有关分子机制需进一步深入研究。

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