HCMV重组嵌合抗原表达质粒构建及免疫反应的初步鉴定

曾宪聪，汪小五，陈 伟，王林定，2

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)又称为人疱疹病毒5型，属β-疱疹病毒亚科，HCMV感染极为普遍，在育龄期妇女中感染率可达95%以上［1－2］。此外，HCMV感染可通过胎盘侵袭胎儿引起先天性感染，少数造成早产、死产或生后死亡［3］。母婴感染HCMV的快速诊断对于决定是否保留胎儿，及采取何种干预措施非常重要。目前国内外已有多家实验室及试剂生产厂家研制生产HCMV IgM抗体检测试剂盒，由于缺乏灵敏度强和特异性高的抗原以及生产条件和标准各异［4］，因此该实验进一步研究HCMV相关基因为实验室诊断与应用提供支持，提高我国孕妇早期HCMV感染的检出率。

1 材料与方法

1.1 材料来源 pQE-80L、菌株BL21(DE3)由本实验室保存。

1.2 主要试剂 PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ购自日本TaKaRa公司;PVDF膜购自上海生物工程有限公司;Ni2+-NTA亲和层析柱购自美国GE公司;50 ml亲和层析预装柱购自上海生物工程有限公司;HRP标记山羊抗人IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;ECL化学发光试剂盒购自瑞士Thermo公司。

1.3 重组表达质粒的构建

1.3.1 HCMV抗原片段引物设计 利用Protean软件分析了 UL32［5－6］、UL44［7］、UL83［8－9］、氨基酸序列，抗原性强且亲水性好的片段。分析了 UL32、UL44、UL83氨基酸序列。选择 UL32A(372aa～442aa，213 bp)UL32B(522aa ～ 552aa，93 bp)、UL32C(705aa～727aa，69 bp);UL44选择2个片段，分别为 UL44A(1aa ～40aa，120 bp、)UL44B(403aa～421aa，57 bp);UL83选择 3个片段，分别为UL83A(169aa ～ 271aa，309 bp)、UL83B(361aa ～478aa，354 bp)、UL83C(535aa ～ 561aa，81 bp)。选取在蛋白质N端和C端之间的区域，Jameson-wolf抗原决定簇选正分高处;Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。最后将选择好的氨基酸序列连成一条完整序列，预测重组蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性。预测网址:http://biotech.ou.edu/。然后根据选定基因段序列，设计合理引物。各基因的片段用Overlap PCR方法连接，引入 PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ酶切位点，Overlap PCR引物设计，在引物A2的3'端加入了B基因5'端的序列，在引物B1的5'端加入了20个A基因3'端序列。由于需要构建到pQE-80L的质粒中，故在每个融合基因的两端加入酶切位点，在引物B2的3'端加入BamHⅠ的酶切位点，引物A1的5'端加入BglⅡ与SalⅠ酶切位点，便于引入新的基因片段。见表1。

1.3.2 含目的基因的克隆载体和表达载体的构建PCR产物胶回收，按DNA回收试剂盒说明进行操作。回收的PCR产物与pQE-80L载体进行双酶切，酶切后的产物转化至Top10感受态细胞，挑取过夜培养的单菌落，接种于5 ml含Amp的LB培养基的试管中，37℃培养过夜，提取质粒，(按质粒提取试剂盒的说明书操作)。质粒经PCR(PCR反应体系:94℃变性3 min;94℃ 30 s;55℃ 30 s;72℃ 1 min;循环35次，72℃延伸10 min)。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物和酶切产物。质粒和酶切产物送至上海生物工程有限公司进行序列测定。

表1 重组质粒引物

1.3.3 重组质粒 pQE-80L-UL32-UL44-UL83转化将pQE80-L重组质粒转化入BL21(DE3)中，冰浴30 min，42℃水浴中热击60 s，冰浴5 min。加入600 μl LB培养基，于37℃、200 r/min摇床培养45 min后，离心后将菌液均匀涂布在含Amp抗生素的LB固体培养基上，37℃ 倒置培养过夜。

1.3.4 目的蛋白的诱导、表达与纯化 挑取转化了含有目的片段的pQE-80L重组质粒的BL21(DE3)单菌落，接种到3 ml含Amp的LB液体培养基中，37℃恒温摇床200 r/min培养过夜后，按1∶50转种2～4 h(OD600达0.5左右)取1 ml做诱导前对照，按1∶1 000加入诱导剂(IPTG)终浓度为1 mmol/L，次日取5 ml复苏后的菌液转种到500 ml含Amp的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。样品加入终浓度1 mmol/L的IPTG。培养6、8 h各取1 ml培养物作为诱导后样品4 000 r/min离心10 min收集剩余菌体。两次取样用于SDS-PAGE电泳分析诱导情况。

含重组菌的LB培养液(500 ml)7 000 r/min离心30 min用裂解缓冲液(非变性)悬浮沉淀的菌体。加入终浓度为1 mg/ml溶菌酶及终浓度为1 mmol/ml蛋白酶抑制剂PMSF，冰上放置30 min。超声波破碎仪破碎菌体8 000 r/min离心30 min，过滤收集上清液即为上清粗蛋白(目的为防止有杂质堵住柱头避免柱流速度过慢)。沉淀加含8 mol/L尿素的变性裂解缓冲液50 ml室温溶解8 000 r/min离心30 min后取上清液过滤后即为包涵体粗蛋白。分别取少量上清液和包涵体样品电泳确定目的蛋白的表达部位。

Ni-NTA填料的预处理:用10倍柱体积的ddH2O清洗Ni2+亲和层析柱，用10倍的裂解缓冲液平衡柱子后，将已预处理好的Ni-NTA悬浮液混匀填装柱子，柱体积达到约1.5 ml。将上清液或包涵体蛋白质样品反复上柱2～3次。依次用5倍柱体积的裂解缓冲液(pH 8.0);5倍柱体积的洗涤缓冲液(pH 6.3)过柱，洗脱杂蛋白;用 5倍柱体积的洗脱缓冲液(pH 5.9)将吸附在Ni柱中的目的蛋白洗脱，控制流速0.5 ml/min左右分管收集洗脱样品。纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定。

1.3.5 Western blot法检测目的蛋白免疫原性 蛋白样品，经SDS-PAGE分离后转移至 PVDF膜上，Western blot按照(分子克隆)所述方法，所用一抗(1∶100)为HCMV确诊患者阳性血清和普通人群正常血清各一份。而二抗HRP标记山羊抗人IgG抗体(1∶15 000)加入化学发光剂，曝光，拍照。

2 结果

2.1 重组融合抗原表达质粒PCR鉴定 获得的重组质粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83，经 PCR扩增鉴定，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳扩增出约1 356 bp大小的相应基因片段。证明该融合抗原表达质粒均已构建成功，送样至上海生物工程有限公司进行序列测定，序列比对正确。见图1A。

2.2 重组融合抗原表达质粒酶切鉴定 挑取重组质粒 pQE80-L-UL32-UL44-UL83，用 BamHⅠ，SalⅠ做双酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳验证，电泳出现1 356 bp大小的条带，证明PQE-80L表达载体质粒构建成功。酶切有目的条带的重组质粒送上海生物工程有限公公司进行测序，测序结果正确。见图1B。

2.3 HCMV重组融合抗原蛋白诱导表达与纯化将HCMV重组融合抗原质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中，ITPG诱导后，重组蛋白成功表达

图1 pQE80-L-UL32-UL44-UL8目的基因PCR扩增和重组质粒双酶切鉴定A:HCMV重组融合抗原表达质粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83质粒酶切电泳图;B:HCMV重组融合抗原表达质粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83 PCR产物电泳图;M:Marker;1:重组 pQE80-L-UL32-UL44-UL83质粒双酶切;2:PCR产物

于大肠杆菌中，并经SDS-PAGE电泳分析诱导情况，电泳显示重组蛋白以包涵体形式表达。包涵体粗蛋白经过Ni亲和层析纯化，见图2，含pQE80-L-UL32-UL44-UL83/BL21(DE3)表达含大小约为52 ku的蛋白，SDS-PAGE电泳6～7泳道显示约在50 ku处有条带，与预期目的蛋白大小相一致;但在约70 ku的位置也出现了一条带，考虑其为蛋白特异性条带。

图2 HCMV重组嵌合抗原蛋白pQE80-L-UL32-UL44-UL83/BL21(DE3)的诱导表达与纯化M:Marker;1:重组菌诱导前;2～3:重组菌诱导后6、8 h;4:重组菌破碎后上清液;5:重组菌破碎后包涵体;6～7:重组菌体Ni2+-NTA柱纯化

2.4 Western blot法鉴定免疫反应性 纯化了的目的蛋白经SDS-PAGE电泳之后，转至硝酸纤维素膜上，进行Western blot鉴定，诱导前后与纯化后的结果。见图3。通过ELISA筛查出阳性和阴性血清各一份作为一抗;诱导的菌体蛋白中没有和HCMV阳性血清反应的条带，但是有一些非特异性的条带，发现在诱导后和目的蛋白纯化后的样品在预期分子量处出现了特异性的条带，这和上图诱导纯化后条带相符，而且反应性很强。初步证实此重组融合抗原是HCMV的特异性抗原;具有免疫反应性。

图3 Western blot法分析重组融合抗原蛋白pQE80-L-UL32-UL44-UL83A:HCMV阳性血清反应;B:HCMV阴性血清反应;M:Marker;1:诱导前样品;2:诱导后样品;3:Ni2+-NTA纯化后蛋白样品Western blot HCMV+是与阳性血清作为一抗有反应，HCMV－是与阴性血清作为一抗均没有反应

3 讨论

本实验分析了 HCMV UL32、UL44、UL83蛋白抗原性强且亲水性高的氨基酸片段，分别编码抗原p150、p52、pp65 具有很好的抗原性;有文献［10－11］报道多种巨细胞病毒抗原组合可以获得比单一重组抗原更好的结果，国内方毅 等［11］报道用重组嵌合抗原gp52和PP150的抗原性做了检测分析，阳性率也达到了 92%。国内孙鹏 等［12］报道了 p150、p52、pp65的灵敏度/特异性分别是70%/100%、80%/100%、73.3%/100%，Landini et al［13］对 UL44、UL80a单一片段的重组抗原和多功能重组抗原做了比较，证明多种巨细胞抗原重组阳性检出率(98%)明显高于单片段重组抗原阳检率(72%)。从结果可知重组单片段优势抗原可以克服全病毒假阳性反应，但是阳性检出率较低;用重组巨细胞病毒融合抗原可获得比单一片段重组抗原更好的结果。综上文献报道都充分证实了选用多个基因片段构建的重组嵌合抗原检测HCMV可以大大提高感染检出率，检测早期活动性的感染，其实际价值远远大于单片段的检测［13］。因此笔者通过将HCMV各基因相应氨基酸序列相融合，通过与pQE80-L质粒连接，构建重组表达质粒，再通过不断酶切连接的方法，成功构建HCMV重组融合抗原表达质粒pQE80-L-UL32-UL44-UL83;其酶切后大小如图1所示为1 356 bp，且序列测序比对正确。重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)后，可成功表达，经SDS-PAGE分离及Western blot验证，确证其为目的蛋白。重组菌在经终浓度为1 mmol/L IPTG成功诱导6～8 h后，收集并破碎菌体，经确认其表达是在包涵体中。通过Ni2+-NTA进行初步纯化，含His-Tag的蛋白可被洗脱。但由于重组融合抗原蛋白较大，容易出现比目的蛋白较大的条带;如图2结果显示在分子量(Marker)50 ku处有目的条带出现，但是约在70 ku显示有一条条带，在图3的Western blot鉴定中得到证实考虑为重组融合抗原的特异性条带;与血清结合反应也证实了该重组嵌合抗原其具有很好免疫反应性和特异性。

由于HCMV目前诊断没有统一的标准及其标准的诊断试剂盒。有报道［14］表明间接ELISA的抗HCMV-IgM阴性并不能排除HCMV感染的可能性。设计这种重组质粒，可以在后续试验中进行比较重组蛋白的特异性及灵敏度。提高孕妇HCMV早期感染检出率;提高优生优育，及其他相关疾病的发生;开发HCMV早期诊断的快速、灵敏的诊断试剂盒，就显得更有意义。

［1］饶美兰，郑 瑛，张畅斌.孕妇巨细胞病毒感染及其母婴垂直传播［J］.中国生育健康杂志，2008，19(2):95 －8.

［2］Odeberg J，Wolmer N，Falci S，et al.Late human cytomegalovirus(HCMV)proteins inhibit differentiation of human neural precursor cells into astrocytes［J］.J Neurosci Res，2007，85(3):583 －93.

［3］Neirukh T，Qaisi A，Saleh N，et al.Seroprevalence of Cytomegalovirus among pregnant women and hospitalized children in Palestine［J］.BMC Infect Dis，2013，13(1):528.

［4］范行良，英志芳.人巨细胞病毒IgM抗体国家参考品的研制［J］.微生物学免疫学展，2012，40(3):30 －2.

［5］Sampaio K L，Cavignac Y，Stierhof Y D，et al.Human cytomegalovirus labeled with green fluorescent protein for live analysis of intracellular particle movements［J］.J Virol，2005，79(5):2754 －67.

［6］Ma Y，Gao S，Wang L，et al.Analysis and mapping of a 3＇coterminal transcription unit derived from humancytomegalovirus open reading frames UL30-UL32［J］.Virol J，2013，(10):65.

［7］Beqaj S H，Lerner A M，Fitzgerald J T，et al.Immunoassay with cytomegalovirus early antigens from gene products p52 and CM2(UL44 and UL57)detects active infection in patients with chronic fatigue syndrome［J］.J Clin Pathol，2008，61(5):623 －6.

［8］白 剑，肖 漓，石炳毅，等.器官移植术后人巨细胞病毒感染的实验室诊断研究进展［J］.中国误诊学杂志，2008，8(12):2791－3.

［9］杨美芳，高海女，范 骏，等.pp65抗原血症监测异基因造血干细胞移植受体CMV的感染［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2006，26(11):993.

［10］Bernard W，Annemarie B，Holger R，et al.Human cytomegalovirus infection:diagnostic potential of recombinant anigens for cytomegalovirus antibody detection［J］.J VirolMethods，2001，96(2):157－70.

［11］方 毅，司炳银，祝庆余，等.巨细胞病毒ppl50和gp52融合基因的克隆表达及重组蛋白的抗原性研究［J］.中华检验医学杂志，2006，29(4):365 －6.

［12］孙 鹏，孙兴宝，胡 鹏，等.重组人巨细胞病毒(HCMV)优势表位嵌合抗原的构建表达以及捕获法检测IgM抗体［J］.遗传，2007，29(11):1351 －6.

［13］Landini M P，Lazzarotto T，Maine G T，et al.Recombinantmono and polyantigens to detect cytomegalovirus specific immunoglobulin M in human sera by enzyme immunoassay［J］.J Clin Microbiol，1995，33(10):2535 －42.

［14］张新萍，李 沛.酶联捕获法检测抗人巨细胞病毒-IgM抗体的实验分析［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2003，17(3):285.