PRB介导子宫内膜癌细胞对MPA敏感性的作用机制研究

王 晶，孙 笑，王丽华，王玉东

（上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院妇科，上海 200030）

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是最常见的妇科恶性肿瘤之一，年轻的内膜癌患者也相对增加。5%～14%的内膜癌患者发病年龄小于40岁，多有肥胖、不育、多囊卵巢综合征及月经不调，保留生育 /内分泌功能成为年轻患者的强烈要求。目前，孕激素长期、大量应用为年轻子宫内膜癌患者保守治疗及晚期、复发患者的主要方法。孕激素对子宫内膜不典型增生、低级别子宫内膜癌的反应率分别为67%～82%、50%～70%，仍有一部分分化良好的年轻早期患者激素治疗无效，出现复发和转移，最终采取手术切除子宫。孕激素主要是通过孕激素受体B（progesterone receptor B，PRB）抑制肿瘤的生长。本研究在分析PRB介导内膜癌细胞对孕激素敏感性的基础上，进一步探讨PRB下调后，MPA对内膜癌细胞生物学行为的影响及相关机制，为正确选择内膜癌的治疗方法，提高疗效提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa购自美国模式菌种收集中心 （ATCC）。细胞培养基DMEM-F12、胎牛血清 （FBS）购自美国Gibco公司。MTT、MPA为Sigma公司产品，DMSO购自Amresco公司。MPA以DMSO溶解为浓度10 mol·L-1的储存液，充分溶解后分装，-20℃保存，培养液中DMSO的终浓度不超过0.1%。兔抗人ERK、p-ERK多克隆抗体为CST公司产品，TRIzol为Invitrogen公司产品，逆转录试剂盒及PCR试剂盒为TaKaRa公司产品，引物由上海生工公司合成，蛋白Marker为 Thermo公司产品，慢病毒包装系统由pENTR/U6-shRNA载体、PL/IERES/GFP/U6载体、pIRES2-EGFP-prb载体组成，购自上海诺百生物科技有限公司，Matrigel胶购自BD公司，Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 细胞生长于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中，37℃、5%CO2常规培养，每1～2天换液1次。

1.2.2 慢病毒载体的制备 选择GenBank中人PRB基因编码区序列（NM000926.4）作为分析序列，设计、合成4对针对PRB基因shRNA的寡核苷酸序列。据其对PRB基因的抑制率，确定最佳干扰序列为：5′-CACCGCATGATCTTGTCAAACAACTCGA AAGTTGTTTGACAAGATCATGC-3′。构成表达 shRNA的重组慢病毒质粒载体，并行酶切鉴定。

1.2.3 慢病毒包装及滴度测定 PRB shRNA的重组慢病毒质粒载体及两种辅助载体共转染293T细胞，培养48 h后，收集细胞培养上清，浓缩后得到高滴度慢病毒浓缩液，采用10倍系列孔稀释后，转染293T细胞。

1.2.4 细胞分组及感染 细胞分为干扰组IskshRNA-PRB、阴性对照组 Isk-shRNA-NC、空白对照组Isk，将细胞悬液接种于96孔板，常规培养，细胞覆盖80%左右时，根据MOI值，进行病毒侵染实验，收集感染成功率80%以上的细胞，抽提RNA及蛋白分别进行qPCR及Western blot，检测靶点的干扰效率。

1.2.5 qPCR测定PRBmRNA 按照试剂盒操作步骤，抽提上述3组Ishikawa细胞总RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度。PCR反应条件：95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以上实验重复3次。

1.2.6 MTT法检测细胞增殖能力 每孔约8×103细胞接种至96孔板，每组设8个平行孔，干扰组分别加入不同浓度的 MPA（0.01、0.1、1、10μmol·L-1），以加等体积DMSO作为溶剂对照。酶标仪测490 nm处吸光度值，绘制生长曲线。实验重复3次。

1.2.7 Transwell法测定侵袭能力 用 Matrigel 1∶6稀释包被Transwell小室底部，小室外加500μl含10%胎牛血清培养液，小室内加入100μl不含血清细胞悬液，细胞密度为5×108·L-1，24 h后取出小室，经固定、染色，200倍镜下取5个视野计数穿膜细胞数，取其平均数。

1.2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞接种24 h后，换以无血清培养液培养18 h，加入10μmol·L-1MPA，以加相同体积的DMSO作为溶剂对照，终浓度不超过0.1%。于48 h收集细胞，重悬并加入Annexin V-7AAD、PE染料，混匀，避光。1 h内，应用流式细胞仪检测。

1.2.9 Western blot检测 SDS细胞裂解液裂解细胞，SDS-PAGE电泳分离蛋白，Bio-Rad微型电转移系统将蛋白转移至硝酸纤维膜上，封闭1 h，加兔抗人PRB多克隆抗体 （1∶500稀释）、兔抗人ERK（1∶1 000稀释）及p-ERK抗体 （1∶1 000稀释），4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，ECL发光，X线胶片显影、定影并扫描记录，以β-actin为内参，以上实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 15.0软件进行统计，实验数据采用¯x±s表示，各组的组间均数比较用方差分析。

2 结果

2.1 慢病毒载体的制备、鉴定、滴度测定及感染PRB shRNA重组慢病毒载体质粒转化DH5α大肠杆菌，细菌阳性克隆经PCR扩增，PCR产物1 954 bp。测序结果表明，插入的片段与设计的PRB shRNA序列一致，没有突变、缺失、插入等异常存在。以293T细胞GFP蛋白的表达水平为对照，经逐孔稀释滴度法测定慢病毒浓缩液滴度为2×105Tu·L-1，说明有大量质粒转入293T细胞，病毒包装成功。

2.2 慢病毒感染对Ishikawa细胞PRB表达水平的干扰效率鉴定 qPCR结果显示，Isk-shRNA-PRB组细胞中PRB mRNA的表达量仅为Isk-shRNA-NC组细胞的39.5%，即抑制率为60.5%，而阴性对照组与空白对照组细胞的PRB mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与阴性对照组相比，干扰组Ishikawa细胞PRB的mRNA水平明显降低 （P＜0.05）。Western blot结果显示，干扰组细胞中PRB蛋白的表达量仅为阴性对照组的38.7%，即抑制率为61.3%，而阴性对照组与空白对照组细胞的PRB蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。说明与阴性对照组相比，干扰组Ishikawa细胞PRB的蛋白水平下降 （P＜0.05）。

2.3 干扰PRB表达，促进Ishikawa细胞增殖、侵袭，抑制凋亡 MPA可抑制空白对照组和阴性对照组Ishikawa细胞的增殖活性，1、10μmol· L-1的MPA抑制率分别为17.6%、43.8%，与干扰组相比差异均有统计学意义 （P＜0.01），见 Fig 1A。而MPA对Isk-shRNA-PRB组细胞无抑制增殖的作用，高浓度MPA（10μmol· L-1）作用d 3反而促进细胞增殖，促增殖率为17.9% （与空白对照组和阴性对照组相比均有P＜0.01），见Fig 1B。

侵袭实验结果显示，Isk-shRNA-PRB组细胞穿过人工基底膜的平均数为101，明显多于阴性对照组（53）和空白对照组（48），差异具有统计学意义（P＜0.01），见 Fig 2。

MPA可诱导对孕激素敏感的Ishikawa细胞凋亡，MPA作用48 h，凋亡比例与干扰组比较差异具有统计学意义 （P＜0.01），见Fig 3。

2.4 慢病毒感染Ishikawa细胞后PRB蛋白的表达情况及MAPK通路的激活 MPA作用24 h，检测ERK磷酸化情况，结果显示：MPA激活干扰组细胞p-ERK相关的MAPK/ERK信号通路，而空白对照组和阴性对照组ERK磷酸化较弱或无，见Fig 4。

Fig 1 Effects of MPA on proliferative activity and growing abilityA：Effects of different concentrations of MPA on the proliferation of the Isk，Isk-shRNA-NC and Isk-shRNA-PRB cells；B：Effects of MPA（10μmol· L-1）on the growing ability of Isk，Isk-shRNA-NC and IskshRNA-PRB cells.**P＜0.01 vs Isk or Isk-shRNA-NC

Fig 2 Effects of MPA on capacity of invasionRepresentative imagesof Transwell invasion assay using10%FBSas chemoattractant showed thatafter treatmentwith MPA（10μmol· L-1）for 24 h，Isk-shRNA-PRB cells increased the capacity of invasion.Statistical data are shown below the figures.**P＜0.01 vs Isk or Isk-shRNANC

Fig 3 Effects of MPA on cell apoptosisThe effectson cellapoptosisof Isk，Isk-shRNA-NC and Isk-shRNA-PRB cells，after treatmentwith MPA（10μmol· L-1）for48 h.Statistical data are shown.**P＜0.01 vs Isk or Isk-shRNA-NC

3 讨论

目前，肥胖和多囊卵巢综合征越发流行，绝经前女性内膜癌发病率逐年上升，孕激素对该病的防治尤为重要［1］。超过30% 分化良好的Ⅰ型子宫内膜癌患者对孕激素治疗无反应［2］，其潜在的机制不甚了解。

孕激素受体（PR）是细胞内受体，属于甾体激素受体超家族的一种结构复杂的蛋白质，其调控众多目标基因的转录［3］。PR具有两种亚型，即PRA和PRB，它们是同一基因经不同启动子转录而来。与PRB相比，PRA在氨基端缺少164个氨基酸，因而PRA和PRB具有不同的活性和功能。研究表明：表观遗传机制如DNA甲基化和组蛋白修饰对调控PRA和PRB总蛋白的表达至关重要［4］。子宫内膜癌细胞从孕激素敏感到耐药存在一种假说：由于编码PRB的DNA发生甲基化，导致PRB表达下降，抑制黏附分子和细胞周期调控蛋白的表达，并促进凋亡抑制蛋白BIRC3的表达，从而促进转移、增殖，抗凋亡。另一项研究表明，子宫内膜癌细胞PRB表达下降很可能是孕激素治疗失败的症结［5］。也有研究提示，PTEN基因与子宫内膜癌细胞耐药密切相关［6］。

大剂量孕激素对分化良好、雌激素受体 （ER）和PR阳性的内膜癌患者反应率高［7］。对于子宫内膜癌细胞，表达内源性或重组PR，孕激素治疗可抑制细胞生长、浸润，同时促进分泌表型的分化和诱导复制性衰老［8］。维持PR表达水平，尤其PRB水平对孕激素的抗肿瘤作用至关重要。有研究表明，孕激素对细胞生长和浸润的抑制作用主要通过PRB的激活［9］。PRB表达水平降低的子宫内膜癌患者通常预后不佳，可能由于MPA耐药所致［9］。本实验将ER、PR阳性，对孕激素抑制作用敏感的人子宫内膜癌Ishikawa细胞进行慢病毒载体构建，干扰PRB表达，结果表明，内膜癌细胞PRB表达下调，对MPA生长抑制作用耐受。

孕激素能够影响耐药细胞的生物学行为。有研究表明，MPA可通过下调CyclinD1、MMP2、MMP9基因的表达，抑制内膜癌细胞增殖及侵袭能力［10］。在孕激素核受体缺失时，孕激素起到有丝分裂原作用，促进肿瘤细胞增殖［11］。本实验结果表明，干扰PRB表达，孕激素促进子宫内膜癌细胞增殖、侵袭，抗凋亡。孕激素对PRB下调后，癌细胞生物学行为影响的作用机制尚无明确认识。一般认为，孕激素通过与其特异性靶细胞结合后刺激分化，可使内膜发生分泌期改变，促使内膜癌细胞分化趋向成熟，细胞发生凋亡和萎缩，抑制肿瘤生长［7］。有研究认为，孕激素可直接作用癌细胞，延缓DNA、RNA的复制，抑制癌细胞生长。还有研究提出，孕激素经PRB介导促进黏附分子表达，如整合素、纤维结合素、钙黏蛋白6，抑制内膜癌细胞迁移、浸润［9］。MAPK通路是将促有丝分裂信号传递到核内，引起细胞增殖分化的主要信号转导系统。激活的ERK1/2与细胞增殖、分化密切相关。pERK1/2进入胞核内，促使cjun、c-fos、c-myc等原癌基因的表达，细胞由G1期进入S期，促进癌细胞恶性增殖。另外，ERK可调节cyclinE，同时灭活细胞周期抑制蛋白P27KIP的表达，从多个水平调控细胞周期。研究报道，ERK可使一些分子发生磷酸化，如转录因子ELK-1、CCAAT增强结合蛋白β、cAMP反应元件结合蛋白，促使Bcl-2抗凋亡因子表达增加［12］。另有研究发现，pERK1/2活性增高与基质金属蛋白酶类的分泌及α6整合素的高表达密切相关，表明ERK1/2可通过蛋白分解调控癌细胞的恶性行为［13］。本研究提示，MPA使PRB下调的子宫内膜癌细胞发生明显的ERK磷酸化，对敏感细胞则ERK磷酸化较弱或无。说明孕激素对PRB下调的Ishikawa细胞存在不通过与PR结合的途径，而是有其他路径激活ERK/MAPK信号通路，促进增殖、侵袭。

综上所述，PRB表达情况与保守治疗的成功率密切相关。研究孕激素作用机制，为解决年轻早期子宫内膜癌患者的生育要求具有一定的临床意义。

Fig 4 Effects of MPA on phosphorylation of ERK geneDetection of the phosphorylation of ERK gene in Isk，Isk-shRNA-NC and Isk-shRNA-PRB cells，after treatmentwith MPA（10μmol· L-1）for 24 h.

参考文献：

［1］ Cade T J，Quinn M A，Rome R M，Neesham D.Long-term outcomes after progestogen treatment for early endometrial cancer［J］.Aust N Z JObstet Gynaecol，2013，53（6）：566-70.

［2］ Kim J J，Chapman-Davis E.Role of progesterone in endometrial cancer［J］.Semin Reprod Med，2010，28（1）：81-90.

［3］ Wetendorf M，DeMayo F J.The progesterone receptor regulates implantation decidualization，and glandular development via a complex paracrine signaling network［J］.Mol Cell Endocrinol，2012，357（1-2）：108-18.

［4］ Yang S，Xiao X，Jia Y，et al.Epigenetic modification restores functional PR expression in endometrial cancer cells［J］.Curr Pharm Des，2014，20（11）：1874-80.

［5］ Janzen DM，RosalesM A，Paik D Y，etal.Progesterone receptor signaling in themicroenvironment of endometrial cancer influences its response to hormonal therapy［J］.Cancer Res，2013，73（15）：4697-710.

［6］ 许成芳，李小毛，李 田，王小韵.紫杉醇对PTEN不同状态的子宫内膜癌细胞株的作用及其机制探讨［J］.中国药理学通报，2011，27（11）：1528-32.

［6］ Xu C F，LiXM，Li T，Wang X Y.The effectof taxol on endome-trial cancer cells with different PTEN status［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（11）：1528-32.

［7］ 王玉东，艾志宏，罗来敏.保留生殖功能的子宫内膜癌治疗研究进展［J］.国际肿瘤学杂志，2007，34（7）：535-7.

［7］ Wang Y D，Ai ZH，Luo LM.Therapeuticprogress in keeping fertility for endometrial carcinoma［J］.J Int Oncol，2007，34（7）：535-7.

［8］ Smid-Koopman E，Blok L J，Kuhne L C，etal.Distinct functional differences of human progesterone receptors A and B on gene expression and growth regulation in two endometrial carcinoma cell lines［J］.JSoc Gynecol Investig，2003，10（1）：49-57.

［9］ DaiD，Wolf DM，Litman E S，etal.Progesterone inhibits human endometrial cancer cell growth and invasiveness：down-regulation of cellular adhesion molecules through progesterone B receptors［J］.Cancer Res，2002，62（3）：881-6.

［10］赵书君，程晓军，丰有吉.孕激素的长期作用对子宫内膜癌Ishikawa细胞生物学行为的影响［J］.分子细胞生物学报，2007，40（2）：103-12.

［10］Zhao S J，Cheng X J，Feng Y J.Influence of long-term treatment with MPA on the biological character of endometrial carcinoma Ishikawa cell［J］.JMol Cell Biol，2007，40（2）：103-12.

［11］Hanekamp E E，Kuhne LM，Grootegoed JA，et al.Progesterone receptor A and B expression and progestagen treatment in growth and spread of endometrial cancer cells in nudemice［J］.Endocr Relat Cancer，2004，11（4）：831-41.

［12］Kousteni S，Han L，Chen JR，et al.Kinase-mediated regulation of common transcription factors accounts for the bone-protective effects of sex steroids［J］.JClin Invest，2003，111（11）：1651-64.

［13］Ahmed N，Pansino F，Baker M，et al.Association between alphavbeta6 integrin expression，elevated p42/44 kDa MAPK，and plasminogen-dependentmatrix degradation in ovarian cancer［J］.JCell Biochem，2002，84（4）：675-86.