杜仲提取物中4种主要成分在Caco-2细胞的摄取特性研究

兰燕宇，刘 跃，曹 旭，牟景丽，王爱民，郑 林

（贵阳医学院1.药学院贵州省药物制剂重点实验室、2.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）又名木绵、思仙、思仲、丝棉皮、扯丝皮、川杜仲等，为杜仲科植物杜仲属的落叶乔木。其皮、茎、叶均可入药，是一味名贵中药材，主要产于贵州、四川、湖北、浙江等省［1］。国内外对杜仲的化学成分和药理作用的研究已取得很大的进展，研究结果表明，其中木脂素类化合物（松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷）是杜仲的主要降压部位，能较好地代表杜仲的整体效应，其降压作用确切，具有良好的开发前景，另京尼平苷酸具有预肪性功能低下、增强记忆功能、抗癌、抗氧化、泻下、促进胆汁分泌及降压作用［2］。Caco-2细胞系（human colon carcinoma cell line）来源于人结肠腺癌细胞，容易在体外培养，其同源性较好，结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞，含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，可获得药物的摄取、跨膜转运及代谢等信息［3］。把Caco-2细胞模型作为体外中药复方药效研究的“药筛”工具，将中药中大量不能被吸收的复杂成分在体外实验前先行“筛”去，以此增加中药复方制剂体外实验与体内实验的相关性。因此，本试验采用Caco-2细胞模型，结合UPLC-MS/MS法考察杜仲提取物中主要成分松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷苷、京尼平苷酸、原儿茶酸在Caco-2细胞中的摄取特点，国内外未见相关文献报道，以期为杜仲提取物的口服制剂研发提供一定的科学依据，并为中药的体外吸收机制研究提供参考［4-5］。

1 材料

1.1 仪器 超高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（美国Waters公司）；Allegra 64R高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；ZH-2涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）；CQ 250A-TS超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）；CO2培养箱（Thermo scientific）；超净工作台（苏州净化设备总厂）；Millicell-ERS电位仪（美国 Millipore公司）；功能酶标仪（Thermo3001 VARIOSKAN FLASH）；倒置相差显微镜（日本Olympus）；TGL-16G离心机。

1.2 试剂与试药 京尼平苷酸（批号27741-01-1）、松脂醇二葡萄糖苷（批号201206）、松脂醇单葡萄糖苷（批号070801）、原儿茶酸（批号 X20-20121012）和葛根素（批号110752-200912）对照品购自中国食品药品检定研究院；杜仲提取物自制（批号：20130823）；DMEM培养基（Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，Gibco）、胎牛血清（fetal bovine seurm，Biochrom）、青、链霉素、Hank′s缓冲溶液（HBSS，Gibco）；胰蛋白酶（Trypsin，Sigma）；考马斯亮蓝（20130523，南京建成生物工程研究所）；DMSO、甲醇、乙腈均为色谱纯；实验用水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3 细胞株 Caco-2细胞株（上海中科院），实验用的细胞传代数在50代以内。

Fig 1 SIR chromatogramsA：Blank cell suspension；B：Blank cell suspension spiked with standands；C：Caco-2 cell sample；1：Geniposidic acid；2：Protocatechuic acid；3：Puerarin；4：Pinoresinol diglucoside；5：Pinoresinol singleglucoside

2 方法与结果

2.1 细胞摄取特性考察方法［6-8］参照文献［9］方法进行细胞培养，将培养14 d的细胞用37℃、pH 7.4的HBSS缓冲溶液在培养箱中培养20 min后，吸去缓冲溶液。用HBSS缓冲溶液轻轻冲洗两遍，洗去细胞单分子层表面的杂质。加入含药的HBSS溶液2 ml，置37℃的培养箱中，分别考察培养时间（15、30、60、90、120、180 min）、不同浓度（0.2、0.5、1、2、5 g·L-1）、培养介质不同 pH（4.0、5.0、6.0、7、8）、不同温度（4、25、37）℃以及抑制剂（P-糖蛋白抑制剂维拉帕米、头孢菌素A）对杜仲提取物细胞摄取的影响。按摄取时间取出后，加入4℃的HBSS快速清洗3遍细胞单分子层，加入0.1%Triton X-100（pH 7.4的HBSS溶液配制）细胞裂解液500μl，反复冻融裂解细胞，取出细胞超声10 min，得细胞悬液。取300μl细胞悬液，加入10μl内标，300μl甲醇沉淀蛋白，涡混1 min，15 000 r·min-1离心5 min，取上清2μl进样分析，测定京尼平苷酸等4种成分的浓度；另取10μl细胞悬液以考马斯亮蓝法测定蛋白含量。摄取量以mg（药物）/g（蛋白）表示。

2.2 分析条件 色谱条件：Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）色谱柱；0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱，梯度为0～0.5 min：5%～10%，0.5～3.5 min：10% ～20%，3.5～4 min：20% ～90%，4～5 min：90%～5%，；流速为0.35 ml·min-1；柱温：45℃。进样体积为2μl。

质谱条件：Waters Acquity TQD质谱仪，MassL-ynxV4.1工作站，电喷雾电离源（ESI）；毛细管电压：3kV；离子源温度：120℃；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气为氮气（650 L· h-1）；碰撞气为氩气（0.16 ml·min-1）；扫描方式为选择离子监测模式（SIR），用于定量分析的京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷及葛根素（内标）监测离子反应分别 m/z 373.2；m/z 152.9；m/z 681.3；m/z 519.3；m/z 417.0。

2.3 标准溶液的配制 精密称取京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷适量，用甲醇定容至10 ml，获得京尼平苷酸（1.350 g·L-1）、原儿茶酸（0.974 g·L-1）、松脂醇二葡萄糖苷（1.000 g·L-1）、松脂醇单葡萄糖苷（1.010 g·L-1）的储备液。置冰箱（-20℃）保存，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 比较空白细胞混悬液A、混合对照品溶液B和细胞样品C的色谱行为，在建立的色谱条件下考察其专属性。京尼平苷酸等4种成分及葛根素（内标）的保留时间（RT）分别为 0.99、1.08、1.83、2.40、3.73 min，由 Fig 1可以看出，成分间分离良好，空白细胞混悬液无杂质干扰。

2.4.2 线性关系的考察 取空白细胞混悬液300 μl，依次加入50μl混合标准溶液，10μl内标溶液及300μl甲醇沉淀蛋白，其余按“2.1”项下操作，建立标准曲线。以待测物的峰面积与内标峰面积之比（A/Ai）为纵坐标Y，各物质浓度（C）为横坐标X进行直线回归，权重系数为1/X，求得直线方程，即为标准曲线。京尼平苷酸（Y＝1.158X＋0.56，r＝0.995，0.07～15.98 mg·L-1），原儿茶酸（Y＝2.50X＋0.01，r＝0.997，0.02～5.76 mg·L-1），松脂醇二葡萄糖苷（Y＝0.55X＋0.06，r＝0.996，0.05～11.83 mg·L-1），松脂醇单葡萄糖苷（Y＝1.46X-0.16，r＝0.995，0.05～11.95 mg·L-1），各成分最低检测限（LOD）分别为 3.30、10.27、17.41、11.67 mg·L-1。

2.4.3 准确度和精密度 按“标准曲线”项下分别配制4个成分的低、中、高3个浓度的质量控制样品（QC），每一个浓度进行5样本分析，连续测定3 d，代入当日标准曲线中，分别计算各物质的浓度，求算日间RSD%和准确度。每一个浓度进行5样本分析，日内连续进样，并与标准曲线同时进行。求得京尼平苷酸等4个成分准确度为88.99%～105.15%；日内精密度RSD%为1.29%～13.29%；日间精密度RSD%为1.60%～5.36%。

2.4.4 稳定性实验 用空白细胞混悬液配置上述高浓度的混标溶液，室温放置，分别在1、2、3 d，在所确定的质谱条件下分析，根据京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷色谱峰面积，计算其RSD分别为0.33%、3.23%、4.08%和2.43%。结果表明，杜仲提取物样品溶液在3 d内室温放置条件下稳定性均良好。

2.4.5 回收率 按“标准曲线”项下配制低、中、高浓度同时含4种成分的溶液，但不加入内标，所确定的质谱条件下分析，每个浓度重复3次，经LC-MS/MS测定值与相应浓度直接用流动相配制的样品溶液测定值的比值计算回收率。回收率均大于85%。

2.5 统计学分析 统计分析所得数据以¯x±s表示，组间差异比较用t检验。多组比较，用单因素方差分析。

2.6 Caco-2细胞摄取实验结果

2.6.1 不同浓度受试化合物对Caco-2细胞毒性实验 选取对数生长期Caco-2细胞，以每孔100μl，1×108～2×108个·L-1种植于96孔培养板中，将培养板置37℃、5%CO2培养箱中孵育48 h。实验分为正常对照组、药物组。正常对照组每孔加入100 μl DMEM培养液；药物组：将杜仲提取物稀释至不同体积比浓度：0.5、5、10、20、40 g·L-1，每孔加入100μl，作用Caco-2细胞4 h后，用MTT法检测。每个浓度平行5孔，实验重复3次。抑制率/%＝（对照组OD-实验组OD）/对照组OD×100%。

实验结果表明，在所设置的浓度范围内，随着浓度的增加，杜仲提取物对Caco-2细胞的生长具有抑制作用，提取物浓度在5 g·L-1以上时有细胞毒性（P＜0.05），因此，实验选择浓度在5 g·L-1以下进行下一步的摄取实验。

2.6.2 浓度依赖性摄取实验 取不同浓度（0.2、0.5、1、2.5、5 g·L-1）的杜仲提取物的 Hank′s溶液，然后加入Caco-2细胞中，培养60 min，考察药物浓度对细胞摄取的影响。结果表明，在0.2～5 g·L-1内杜仲提取物中的京尼平苷酸等4个成分的细胞摄取量与浓度呈线性关系，其回归相关系数（r2）均达到0.990以上，表明京尼平苷酸等4种成分的摄取主要表现为被动扩散。结果见Fig 2。

Fig 2 Effect of extract with different concentrations on uptake by Caco-2 cellmonolayers

2.6.3 不同时间对Caco-2细胞摄取的影响 将5 g·L-1杜仲提取物加到细胞中，分别考察不同摄取时间（15、30、60、90、120、180 min）对 Caco-2细胞摄取的影响。结果显示，在不同的摄取时间下，杜仲提取物中的京尼平苷酸、松脂醇单葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷3个成分的细胞摄取量都随着时间的增加而摄取增加，而原儿茶酸随着时间的增加摄取量缓慢降低。综合此结果，本实验将细胞摄取时间定为60 min。结果见Fig 3。

2.6.4 pH值对Caco-2细胞摄取的影响 将5 g·L-1杜仲提取物分别溶于不同 pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的 Hank′s中，在加药 60 min后测定不同pH值对Caco-2细胞摄取杜仲提取物的影响。结果表明，在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0条件下，杜仲提取物中的京尼平苷酸、原儿茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷4个成分的细胞摄取量随着pH的增加，摄取量逐渐降低。结果表明，碱性环境不利于京尼平苷酸等4种成分的吸收，再考虑到小肠的吸收环境，实验选择pH 6作为后续实验的pH环境。结果如Fig 4所示。

Fig 3 Time-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

Fig 4 pH-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

2.6.5 不同温度对Caco-2细胞摄取的影响 将5 g·L-1杜仲提取物加到培养好的细胞中，分别在pH 6、加药60 min后测定不同温度（4、25、37℃）对 Caco-2细胞摄取杜仲提取物的影响。结果表明，在不同温度下，杜仲提取物中的京尼平苷酸等4个成分的细胞摄取量都随着温度的增加而增加，37℃环境下更有利于细胞的摄取。结果如Fig 5所示。

2.6.6 抑制剂对Caco-2细胞摄取的影响［10］按上述所确定的pH 6、37℃作为摄取条件，分别加入含同浓度的杜仲提取物（5g·L-1）溶液、含维拉帕米（25 mg·L-1）的杜仲提取物溶液、含环孢菌素A（10 mg·L-1）的杜仲提取物溶液，分别于给药60 min后，测定有无抑制剂存在时Caco-2细胞对杜仲提取物摄取的变化，数据用¯x±s表示，采用SPSS 18软件，统计采用单因素方差分析。结果见Tab 1。

Fig 5 Tem perature-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

Tab 1 Effect of cyclosporine A and verapam il on uptake byCaco-2 cellmonolayers（±s，n＝3）

Tab 1 Effect of cyclosporine A and verapam il on uptake byCaco-2 cellmonolayers（±s，n＝3）

*P＜0.05 compared with extract.

Composition Uptake/mg·g-1Pro Geniposidic acid 1.08±0.06 Cyclosporine A＋Geniposidic acid 1.04±0.06 Verapamil＋Geniposidic acid 1.08±0.08 Protocatechuic acid 0.4±0.03 Cyclosporine A＋Protocatechuic acid 0.46±0.02*Verapamil＋Protocatechuic acid 0.52±0.04*Pinoresinol diglucoside 1.98±0.14 Cyclosporine A＋Pinoresinol diglucoside 1.89±0.09 Verapamil＋Pinoresinol diglucoside 2.04±0.12 Pinoresinol singleglucoside 0.61±0.01 Cyclosporine A＋Pinoresinol singleglucoside 0.59±0.03 Verapamil＋Pinoresinol singleglucoside 0.61±0.02

3 讨论

药物口服后，小肠是主要的吸收部位，目前应用较多的肠吸收实验方法有：在体肠灌流法（in situ intestinal perfusion）、外翻肠环法（evetred intestinal rings）、外翻肠囊法（evetred gut sacs）和 Caco-2细胞模型法（Caco-2 cell model）等［11］。其中，Caco-2细胞是研究药物肠吸收的理想模型，因接近药物在人体内吸收的实际环境，并具有较高的重现性，兼具快速、易于控制、干扰小、可连续检测等优点，而成为近年来国际公认的用于高通量研究药物肠吸收的常用工具模型［12］。

本实验发现，杜仲提取物在0.2～5 g·L-1内，摄取量受时间、浓度、pH的影响，Caco-2细胞的摄取量与药物浓度呈良好的线性关系，由于在各自相应浓度范围内，细胞摄取表现出一级速率过程的特征，表明杜仲提取物的摄取机制可能为被动扩散。在酸性环境下有利于京尼平苷酸等4种成分的摄取，在中性、偏碱性条件下，药物的摄取明显降低。这可能是由于京尼平苷酸等具有酚羟基结构，显弱酸性，所以中性、偏碱性条件下水解为盐的形式，从而导致膜渗透性降低。随着温度的增加，细胞内酶的活性增加，细胞摄取量也随之增加。

Caco-2细胞表达多种主动转运载体如P-gp、多药耐药相关蛋白（MRP2）等。P-gp可将其底物药排出细胞，降低细胞内药物浓度，P-gp抑制剂可抑制P-gp的外排功能，增加P-gp底物的细胞内浓度。本实验采用Caco-2细胞摄取方法考察京尼平苷酸等4种成分是否是P-gp的底物。实验结果表明，环孢菌素A和维拉帕米对京尼平苷酸等3种成分的摄取量没有明显增加作用，说明京尼平苷酸等3种成分的摄取过程中没有P-gp的参与，而原儿茶酸细胞摄取量明显高于对照组（P＜0.05），即京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷不是P-gp的底物，原儿茶酸是P-gp的底物。

参考文献：

［1］ 张瑛朝，张延敏，郭代云，等.复方杜仲叶合剂对人体降压作用的试验研究［J］.中成药，2001，23（6）：418-21.

［1］ Zhang Y C，Zhang Y M，Guo D Y，et al.Experimental study on hypotensive effect of compound folium eucommiaemixture on body［J］.Chin Tradit Pat Med，2001，23（6）：418-21.

［2］ 晏 媛，郭 丹.杜仲叶的化学成分及药理活性研究进展［J］.中成药，2003，25（6）：491-2.

［2］ Yan Y，Guo D.Advance in study on chemical ingredentand pharmacologocal activities of eucommia ulmoides oliv.Leaves and their utility［J］.Chin Tradit Pat Med，2003，25（6）：491-2.

［3］ 关 溯，陈 孝，黄 民.Caco-2细胞模型——药物吸收研究的有效“工具”［J］.中国药理学通报，2004，20（6）：609-14.

［3］ Guan S，Chen X，Huang M.Caco-2 cellmodle—an effective tool for the research of drug absorption［J］.Chin Pharmacal bull，2004，20（6）：609-14.

［4］ 陈丙銮，李松林，李 萍，等.黄酮类化合物在Caco-2细胞模型中的吸收规律［J］.中国天然药物，2006，4（4）：229-302.

［4］ Chen B L，Li S L，Li P，et al.The uptake characteristics of flavonoids in the Caco-2 model system［J］.Chin JNatMet，2006，4（4）：229-302.

［5］ 董倩倩，李 萍，闻晓东.丹参成分在Caco-2细胞中的吸收研究［J］.中国天然药物，2007，5（1）：59-62.

［5］ Dong Q Q，Li P，Wen X D.Constituents of salvieamiltiorrhizae absorbed by Caco-2 cell［J］.Chin JNatMet，2007，5（1）：59-62.

［6］ 张新峰，裘福荣，蒋 健，等.LC-MS/MS测定药根碱、巴马汀和小檗碱在Caco-2细胞的摄取特性［J］.中国药学杂志，2010，45（19）：1504-8.

［6］ Zhang X F，Qiu F R，Jiang J，et al.Determination of jatrorrhizine，palmatine and berberine in Caco-2 by LC-MS/MSAssay［J］.Chin Pharm J，2010，45（19）：1504-8.

［7］ 张美玲，王新春，黄志巧，等.异甘草素在Caco-2细胞的摄取特性［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（4）：134-6.

［7］ Zhang M L，Wang X C，Huang ZQ，et al.Uptake of isoliquiritigenin in Caco-2 cell monolayer［J］.Chin J Experi Tadit Med，2011，17（4）：134-6.

［8］ 谢海棠，王广基，赵小辰，等.Caco-2细胞对人参皂苷Rg3的摄取及代谢研究［J］.中国临床药理学与治疗学，2004，9（3）：257-60.

［8］ Xie H T，Wang G J，Zhao X C，et al.Study on uptake and metabolism of ginsenoside Rg3［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2004，9（3）：257-60.

［9］ 尤 青，马增春，谭洪玲，等.人参水提物在Caco-2模型的吸收特征［J］.中国药理学通报，2013，29（12）：1711-6.

［9］ You Q，Ma ZC，Tan H L，etal.Absorption characteristicsof Panax ginseng water extract in Caco-2 cell monolayer［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（12）：1711-6.

［10］Yee S.In vitro permeability across Caco-2 cells（colonic）can predict in vivo（small intestinal）absorption in man-fact ormyth［J］.Pharm Res，1997，14（6）：763-6.

［11］曾 宝，王春玲，吴安国，等.Caco-2细胞模型的建立及其在中药吸收研究中的应用探讨［J］.中药新药与临床药理，2010，21（6）：570-3.

［11］Zeng B，Wang C L，Wu A G，et al.Establishment of Caco-2 cell model and exploration of its application to absorption of Chinese medicine［J］.Tradit Chin Dru Res and Clin Pharm，2010，21（6）：570-3.

［12］Hilgers A R，Conradi R A，Burton PS.Caco-2 cellmonolayers as amodel for drug transportacross the intestinalmucosa［J］.Pharm Res，1990，7（9）：902-10.