重组旋毛虫蛋白rTsP38对小鼠肠缺血/再灌注肠损伤的保护作用及机制研究

刘卫锋，温仕宏，李云胜，沈建通，刘克玄

（中山大学附属第一医院麻醉科，广州广东 510080）

肠I/R损伤是临床常见现象，死亡率高［1］。巨噬细胞在肠I/R损伤中起重要作用［2-5］。针对肠巨噬细胞的干预措施，有可能成为肠I/R损伤的有效防治手段。巨噬细胞主要可分为M1和M2型巨噬细胞。研究发现，在脑、肾、心脏等I/R损伤中，M1向M2的转变，能减轻组织损伤，促进组织修复［6-7］。宿主肠道寄生虫感染，能够促进Th2型细胞因子生成、激活M2型巨噬细胞，减轻宿主并存的免疫相关疾病［8-9］。前期研究已证实重组旋毛虫蛋白rTsP38引起小鼠Th2型免疫反应，在M1和M2型巨噬细胞的激活或转变方面可能有调控作用［10］。

本研究拟建立小鼠肠I/R肠黏膜损伤的模型，观察rTsP38对小鼠肠I/R损伤的保护效应，并观察肠I/R损伤对肠黏膜巨噬细胞分型的影响，以及rTsP38对肠黏膜巨噬细胞分型转变的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 正立显微成像系统（Leica公司，德国），ELX800酶标仪（Biotek公司，美国），PTC240PCR仪（Bio-Rad公司，美国），弗氏佐剂（Sigma公司，美国），HRP-山羊抗兔 IgG（Jackson公司，美国），兔抗小鼠CD163抗体（Epitomics公司，美国），兔抗小鼠MPO抗体（BioGenex公司，美国），兔抗小鼠Ki-67抗体（Dako公司，丹麦），TRIzol提取液（Bio-Rad公司，美国），Taq聚合酶（TaKaRa公司，日本），Real-time PCR试剂盒（TOYOBO公司，日本）。

1.2 动物模型制备 SPF级♂ BALB/c小鼠120只，购自广东省医学实验动物中心。术前禁食12h，自由饮水。参照本课题组前期研究方法复制肠I/R损伤模型［11］。小鼠麻醉采用七氟烷，经小动物麻醉机面罩诱导，新鲜气体流量2 L·min-1，吸入浓度5%，维持2%～3%。常规消毒，经腹正中切口，分离肠系膜上动脉（superiormesenteric artery，SMA）后用无创微动脉夹夹闭，缝合切口，60min后经原切口进腹，松开微动脉夹，恢复血供，缝合伤口并消毒，术后自由进食食物和水。

1.3 实验分组与免疫 如Fig 1所示，上述动物随机分为4组：假手术组（S组）：仅行开腹，分离SMA但不夹闭；肠I/R损伤组（I组）：分离SMA，微动脉夹夹闭之后缝合切口，60min后经原切口进腹，松开动脉夹，恢复血流进行再灌注；（3）rTsP38免疫组（T组）：操作同I/R组；（4）佐剂免疫组（A组）：操作同I/R组。免疫方案：建立I/R模型前6周，予小鼠背部皮下多点注射下述试剂，共3次，每次间隔14 d。S组予 PBS 0.2 ml，I组处理同 S组，T组予rTsP38 0.2 ml（含25μg与等体积弗氏完全或不完全佐剂乳化混匀的rTsP38），A组予0.1 ml PBS＋0.1 ml弗氏完全或不完全佐剂乳化混匀的混合液。

Fig 1 Experimental protocols

1.4 实验取材 于建立小鼠肠I/R损伤模型前，尾静脉采血，低温离心，分离血清，放进-80℃冰箱保存，用于rTsP38引起的抗体滴度测定。再灌注2 h（每组10只小鼠）和7 d（每组20只小鼠）后，于深麻醉下断颈处死实验动物。距回肠末端5 cm处相同部位取一约3 cm肠段，除去外膜脂肪组织，平均分为两段。其中一段置于4%多聚甲醛固定12 h，常规石腊切片，用于病理学检测。另一段小肠用4℃PBS溶液冲洗后，置于-80℃低温冰箱保存，用于细胞因子和巨噬细胞标志物检测。

1.5 rTsP38引起的小鼠血清抗体滴度测定 于建立小鼠肠I/R损伤模型前，尾静脉采血，室温放置4 h，冰上放置30～60 min，吸出已析出的血清，2 700×g离心沉淀后，再析出分离的血清，然后10 000×g瞬时离心去除少量红细胞，采用间接ELISA法，按说明书检测小鼠血清抗体滴度变化。

1.6 再灌注后小鼠进食量和体重变化 测量并记录再灌注7 d组存活小鼠每日进食量及再灌注1、2、4及7 d体重变化情况。

1.7 肠黏膜损伤和修复的评价 常规石蜡切片，HE染色。在光学显微镜下观察2 h组小鼠小肠黏膜形态学变化，采用改良Chiu′s评分法评价肠黏膜损伤程度，评分越高，表明损伤越严重［12］。在正立显微成像系统下，观察7 d组小鼠小肠绒毛恢复情况，随机选取8～10个绒毛并测量其绒毛顶端至隐窝的高度。

1.8 qRT-PCR法测定小鼠小肠组织IL-6、IL-10和巨噬细胞标志物NOS2（M 1型巨噬细胞）、Arg-1（M 2型巨噬细胞） 取100 mg小肠组织，采用Trizol一步法提取小肠组织总RNA，并于260 nm和280 nm处测定其OD值，计算OD260/OD280值。以βactin为内参，半定量qRT-PCR法检测 IL-6、IL-10、NOS2和Arg-1 mRNA表达水平。引物设计见Tab 1。

Tab 1 PCR primer design

1.9 小肠组织M 2巨噬细胞标志物CD163、中性粒细胞MPO和增殖细胞K i-67表达检测 常规脱蜡水化后，采用Envision免疫组织化学法测定小肠组织M2巨噬细胞标志物CD163、中性粒细胞MPO和增殖细胞Ki-67表达变化。

1.10 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件分析数据，计量资料以¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey post hoc检验。

2 结果

2.1 小鼠血清抗体滴度变化 rTsP38免疫后小鼠血清IgG1水平明显升高，与S组、I组和A组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。rTsP38免疫后小鼠血清IgG2a水平也明显升高，与S组、I组和A组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但IgG2a升高的倍数明显低于IgG1升高的倍数，差异有统计学意义（P＜0.01，Fig 2）。

Fig 2 Serological antibody response to rTsP38 immunization in m ice（±s）*P＜0.05，**P＜0.01 vs group S，Iand A；＃＃P＜0.01 vs IgG2a

2.2 小鼠进食量和体重变化 再灌注后1 d，I组、T组和A组小鼠进食量明显少于S组，差异有统计学意义（P＜0.05）。T组小鼠于再灌注后2 d进食量明显增加，与S组比较，差异无统计学意义。再灌注后2～7 d，T组小鼠进食量明显高于I组和A组，差异有统计学意义（P＜0.05，Fig 3A）。

再灌注后1、2和4 d，I组、T组和A组小鼠体重增加明显低于S组，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Ⅰ组和A组比较，T组小鼠于再灌注后4 d和7 d体重明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05，Fig 3B）。

Fig 3 Daily food intake and body weight change after intestinal ischem ia/reperfusion（I/R）（±s，n＝7-10）*P＜0.05，**P＜0.01 vs group Iand A；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs group I，T and A

Fig 4 Histopathological changes of intestinalmucosa and the evaluation of intestinal injury with modified Chiu′s scores under lightm icroscopy（hematoxylin and eosin staining，magnification：×200，¯x±s）A，B，C，D represent group S，I，T and A.（n＝9-10，＃P＜0.05 vs group Iand A；**P＜0.01 vs group S）

2.3 小鼠小肠组织光学显微镜下形态学及改良Chiu′s评分变化 光镜下可见S组小肠黏膜组织完整。与S组比较，I组、T组和A组小鼠的小肠组织改良Chiu′s评分均升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。T组小鼠的小肠组织改良Chiu′s评分明显低于I组和A组，差异有统计学意义（P＜0.05，Fig 4）。

再灌注后7 d，T组小鼠小肠绒毛高度明显高于S组、I组和A组，差异有统计学意义（P＜0.01，Fig 5）。与S组、I组和A组相比较，T组小鼠小肠绒毛高度增长了17%～23%。

2.4 小鼠小肠组织IL-6、IL-10和巨噬细胞标志物NOS2（M 1型巨噬细胞）、Arg-1（M 2型巨噬细胞）的表达变化

2.4.1 小鼠小肠组织IL-6表达变化 再灌注后2 h，S组、I组和A组小鼠小肠组织IL-6基因表达变化差异无统计学意义，而T组小鼠小肠组织IL-6基因表达明显高于S组、I组和A组，差异有统计学意义（P＜0.01）。再灌注后7 d，I组、T组和A组小鼠小肠组织IL-6基因表达明显高于S组，差异有统计学意义（P＜0.05或 P＜0.01，Fig 6A）。与再灌注后2 h比较，I组、T组和A组小鼠小肠组织IL-6基因表达分别升高了2.5、14.8和2.6倍。

2.4.2 小鼠小肠组织IL-10表达变化 再灌注后2 h，I组、T组和A组小鼠小肠组织IL-10基因表达明显高于S组，差异有统计学意义（P＜0.01）。再灌注后7 d，I组和A组小鼠小肠组织IL-10基因表达回落，与S组比较，差异无统计学意义；而T组小鼠小肠组织IL-10基因表达明显升高，与S组、I组和A组比较，差异有统计学意义（P＜0.01，Fig 6B）。与再灌注后2 h比较，I组、T组和A组小鼠小肠组织IL-10基因表达分别升高了0.2、317.3和0.2倍。

2.4.3 小鼠小肠组织NOS2表达变化 再灌注后2 h，S组、I组、T组和A组小鼠小肠组织NOS2基因表达变化差异无统计学意义。再灌注后7 d，I组、T组和A组小鼠小肠组织NOS2基因表达明显高于S组，差异有统计学意义（P＜0.01），T组小鼠小肠组织NOS2基因表达明显高于I组和A组，差异有统计学意义（P＜0.01，Fig 6C）。与再灌注后2 h比较，I组、T组和A组小鼠小肠组织NOS2基因表达分别升高了3.1、7.4和4.0倍。

Fig 5 Changes in villus height of intestinalmucosa（hematoxylin and eosin staining，magnification：×200，±s，n＝7-10）**P＜0.01 vs group S，Iand A

Fig 6 Changes of cytokines，Arg-1，and NOS2 mRNA levels in intestine at different reperfusions（±s，n＝5-6）A，B，represent IL-6 and IL-10 mRNA levels in intestine，respectively.C，D，denote Arg-1 and NOS2 mRNA levels in intestine，respectively.**P＜0.01 vs groups Iand A；＃＃P＜0.01 vs group S；ΔΔP＜0.01 vs groups S，Iand A；□P＜0.05，□□P＜0.01 vs2 h

2.4.4 小鼠小肠组织Arg-1表达变化 再灌注后2 h，S组、I组、T组和A组小鼠小肠组织Arg-1基因表达变化差异无统计学意义。再灌注后7 d，T组小鼠小肠组织Arg-1基因表达明显升高，与S组、I组和A组比较，差异有统计学意义（P＜0.01，Fig 6D）。与再灌注后2 h比较，I组、T组和A组小鼠小肠组织Arg-1基因表达分别升高了0.7、134.9和1.4倍。

2.5 免疫组化测定小肠组织M 2巨噬细胞标志物CD163、中性粒细胞MPO和增殖细胞Ki-67表达的变化

2.5.1 CD163免疫组化测定 再灌注后2 h和7 d，T组小鼠小肠组织CD163阳性细胞数较S组、I组和A组明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05或 P＜0.01，Fig 7）。

2.5.2 MPO免疫组化测定 再灌注后2 h，S组和T组小鼠小肠组织可见少量MPO阳性细胞，I组和A组明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。再灌注后7 d，S组、I组、T组和A组小鼠小肠组织MPO阳性细胞数回落，但I组和A组MPO阳性细胞数仍明显高于T组，差异有统计学意义（P＜0.05，Fig 8）。

2.5.3 Ki-67免疫组化测定 再灌注后2 h，T组小鼠小肠组织Ki-67阳性细胞数较I组和A组明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。再灌注后7 d，Ki-67阳性细胞数回落，但T组小鼠小肠组织Ki-67阳性细胞数明显高于S组、I组和A组，差异有统计学意义（P＜0.01，Fig 9）。

Fig 7 Changes of CD163-positive cells in intestine at different reperfusions（¯x±s，n＝5）*P＜0.05，**P＜0.01 vs group S；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs groups S，Iand A；ΔΔP＜0.01 vs2 h

3 讨论

本研究中，再灌注后2 h，I组小鼠Arg-1（M2型巨噬细胞标志物）和NOS2（M1型巨噬细胞标志物）mRNA水平均升高，7 d时Arg-1水平下降，NOS2水平明显升高；与Arg-1和NOS2 mRNA水平变化趋势相似，再灌注后2 h，I组小鼠IL-10和IL-6 mRNA水平均升高，7 d时IL-10水平下降，IL-6水平明显升高。上述结果提示，肠I/R损伤在再灌注早期促进巨噬细胞激活，在后期促进M2向M1型巨噬细胞的转变。Kigerl等［13］在小鼠脊髓I/R损伤的研究中也有类似发现。

M1和M2型巨噬细胞在组织损伤和修复中的作用至关重要。M1向M2型巨噬细胞的转变，对于炎症的恢复具有重要意义。本研究中，rTsP38免疫后T组小鼠血清IgG1水平明显升高，虽然IgG2a也有所升高，但明显低于IgG1水平。与I组小鼠比较，再灌注后7 d，T组小鼠Arg-1和NOS2 mRNA水平均升高，但以Arg-1升高为主（135倍 vs 7倍），CD163＋细胞数明显增多；与Arg-1和 NOS2 mRNA水平变化趋势相似，再灌注后7 d，T组小鼠IL-10和IL-6 mRNA水平均较I组小鼠升高，但以IL-10升高为主（317倍 vs 15倍）。上述结果表明，rTsP38具有很好的免疫原性，并引起宿主偏向Th2型的免疫反应，激活巨噬细胞，并促进了M1向M2型巨噬细胞的转变。

已有研究表明，在脑、肾、心脏等I/R损伤中，M1向M2巨噬细胞的转变，能减轻组织损伤，促进组织修复［6-7］。本研究发现，与I组和A组比较，T组小鼠再灌注后2 h，肠黏膜损伤明显减轻，改良Chiu′s评分明显降低；再灌注后7 d，T组小鼠小肠绒毛高度较其余各组明显增加；此外，T组小鼠进食量、体重变化以及增殖细胞数均明显增加，中性粒细胞浸润明显减少。上述结果表明rTsP38通过促进M1向M2型巨噬细胞的转变，从而减轻肠I/R损伤、促进肠修复和小鼠肠功能恢复。

综上所述，肠I/R激活巨噬细胞并促进M2向M1型巨噬细胞转变；rTsP38促进Th2型免疫反应，逆转肠I/R损伤所致M2向M1型巨噬细胞的转变，并促进M1向M2型巨噬细胞转变，从而减轻小鼠肠I/R所致肠损伤，促进肠黏膜修复和肠功能恢复。

Fig 8 Changes of MPO-positive cells in intestine at different reperfusions（±s，n＝5）ΔP＜0.05 vs group T；**P＜0.01 vs group S；＃＃P＜0.01 vs groups S and T.

Fig 9 Changes of K i-67-positive cells inintestine at different reperfusions±s，n＝5）＃P＜0.05 vs groups Iand A；**P＜0.01 vs groups S，Iand A

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