非洲马瘟VP7蛋白多克隆抗体的制备及IgM捕获ELISA检测方法的建立

郑小龙，朱来华，王 群，艾 军，邓明俊，肖西志，梁成珠，姜 帆，于业锋

（1.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266002；2.云南出入境检验检疫局，云南 昆明 650000）

非洲马瘟（African horse sickness，AHS）是由非洲马瘟病毒（African horse sickness，AHSV）引起的马属动物的一种急性和亚急性虫媒传染病[1-2]。AHS可感染所有马属动物，但以马最为易感，可引起动物发热、皮下水肿及脏器出血，病死率可达90%以上。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。

AHS主要分布在非洲大部，另外在地中海周边国家、中东、欧洲等也有发生，近年来该病已经在亚洲个别国家相继出现，目前我国尚未有AHS感染的报道，但随着世界经济及我国对外贸易的快速发展以及赛马参加国际比赛的机会增多，该病进入我国的风险也随之增大。

目前已发现AHSV有9个血清型[3-4]，其病毒基因组包含10个dsRNA片段，编码7个结构蛋白和3个非结构蛋白[5-6]。其中VP7结构蛋白为主要的内衣壳蛋白，并已证实其为AHSV的群特异性抗原[7-8]，可检测到9个AHSV血清型的抗体。本文利用VP7重组蛋白建立了检测AHS的IgM 捕获ELISA（MAC-ELISA）方法，为非洲马瘟早期感染的诊断提供了技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒及特异血清 VP7原核表达质粒由云南检验检疫技术中心惠赠；阳性血清、阴性血清购自英国动物卫生研究所（IAH）。

1.1.2 试剂 T载体、DNA连接酶 、限制性内切 酶 Bam HI、Xho I、DNA marker， 购自大连Takara公司；rTaq DNA聚合酶、RT-PCR Taqmix、RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自QIAGEN公司； His-Bind®Purif i cation Kit为 Novagen公司产品；琼脂糖、IPTG和DAB显色试剂盒购自上海生工公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；羊抗马IgM购自Abcam公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 VP7表达载体的构建

李富祥[9]等根据VP7基因设计了一对引物用于扩增和鉴定VP基因，上游引物AH1：5’-CCC TCTAGAATGGACGCGATAGCAGCAAAG-3’（下划线部分为Xba I酶切位点），下游引物AH2：5’-GGGAAGCTTCTAGTGGTAGGCTGCTAGC AC-3’（下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点），扩增片段长度为1080bp。将扩增片段插入PET-32a表达载体中，构建pET-VP7表达质粒。

1.2.2 阳性转化菌的诱导表达

将质粒转入表达菌中，然后接种于含100mmol/mL Amp的LB培养基，37℃震荡培养过夜。次日以10%的量接种于含Amp的LB培养基震荡培养至OD600约为0.4～0.6时分别加入1.0mmol/L的IPTG进行诱导培养5h，取样进行SDS-PAGE电泳鉴定。

1.2.3 表达产物的Western-blot鉴定

将经诱导表达的菌液处理后进行SDS-PAGE电泳，按《分子克隆实验指南》介绍的方法进行转印及反应，一抗采用AHSV-1型阳性血清，二抗为羊抗马IgG-HRP。用DAB试剂显色。

1.2.4 重组蛋白质His-Bind柱纯化

根据Novagen公司的His-Bind® Purif i cation Kit说明书进行，取不同时间的洗脱液进行电泳鉴定分析。

1.2.5 多克隆抗体的制备与标记

1.2.5.1 多克隆抗体的制备

将纯化后的 pET-VP7蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀，颈部皮下注射家兔（100μg/只），两周后注射弗氏不完全佐剂与蛋白的混合液，以后每隔两周注射一次，共免疫注射 3次后采血，收集的血清即为多克隆抗体， 用 ELISA 方法测定其效价。

1.2.5.2 多克隆抗体标记

采用Sigma HRP标记试剂盒（P8415）标记多克隆抗体。结合物酶活性和免疫反应性的鉴定，采用直接ELISA法与相应抗原进行反应，即将酶标抗体按1:103，1:104，1:105，1:106稀释后直接与ELISA板上包被的pET-VP7进行反应，测定酶标抗体的效价并选择其最佳工作浓度。

1.2.6 VP7抗原和血清最佳稀释倍数的确定

1）将羊抗马IgM用包被缓冲液作1:400稀释，加入酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。

2）用洗液洗板3次，加入封闭液，每孔200μL，37℃ 2h。

3）用洗液洗板3次，将阴性和阳性血清按照1:50，1:100，1:200，1:400，1:800稀释，每孔加100μL，37℃ 1h。

4）用洗液洗涤3次，加入pET-VP7抗原1:100， 1:200， 1:400， 1:800， 1:1600， 1:3200，1:6400， 每孔加100μL，37℃ 1h。

5） 用洗液洗涤3次，加入HRP标记的pETVP7（1:10000）抗体，每孔加100μL，37℃ 1h。

6）用洗液洗涤3次，每孔加100μLTMB，37℃ 避光 10min。

7）加入终止液，每孔加100μL，450nm读数。

从数值中找出OD值在1.0左右，且阳性血清OD值比阴性血清OD值（P/N值）最高的作为最适稀释度。

1.2.7 酶标抗体最佳稀释倍数的确定

按照1.2.5中确定的抗原及血清最佳稀释倍数，进行试验。将抗酶标抗体作1:5000，1:10000，1:20000，1:50000，1:100000稀释，按照上述步骤进行试验，确定最佳稀释倍数。

1.2.8 特异性评价

应用建立的捕获ELISA方法对AHSV阳性血清（1-9型）、AHSV阴性血清、马动脉炎阳性血清、马动脉炎阴性血清、马鼻肺炎阳性血清、WEEV阳性血清、WEEV阴性血清进行检测，评价所建立方法的特异性。

1.2.9 重复性和稳定性评价

根据批内和批间的变异系数来评价捕获ELISA方法的稳定性。批内差异：使用同一批次包被的酶标板对3份血清进行检测，每份血清设置4个重复，计算其变异系数；批间差异：取4次不同时间包被的酶标板，同时对1份血清进行检测，每块板上设置3个重复孔，计算变异系数。

1.2.10 建立的捕获ELISA方法与进口试剂盒比较

选取180份马血清样品，同时用建立的捕获ELISA与进口试剂盒进行平行检测，对检测结果进行比较分析。

2 结果

2.1 重组蛋白pET-VP7的纯化

将表达蛋白用His-Bind层析柱纯化。取不同时间的洗脱样品进行鉴定，由图1可知目标蛋白仍有较高的浓度，尽管存在极少量的杂蛋白，但目标蛋白占有绝对多的含量，表明纯化效果达到预期的目的。应用BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）检测纯化蛋白含量为500μg/mL。

图1 表达产物的分离与纯化

2.2 Western-blot 结果

经Western-blot 检测，在目标条带所处的位置（54kD左右）出现一条印迹（图2），表明表达产物具有良好的抗原性。

图2 表达产物的免疫印迹分析

2.3 多克隆抗体的制备与标记

免疫三次后采血，分离血清，将待检血清进行10倍系列梯度稀释，ELISA法检测血清中抗体水平（样品设平行）。结果显示，经过三次免疫后pETVP7抗体的滴度大于10-7。将纯化好的血清用Sigma试剂盒进行标记，标记后直接ELISA法进行特异性检测得知，HRP标记的抗pET-VP7抗体的工作浓度为104～105，详细工作浓度按具体试验而定。

2.4 VP7抗原和血清最佳稀释倍数

根据试验结果可知：当抗原 1:800稀释，血清1:100稀释时，阳性对照OD值为1.0左右，且P/N的值最大，因此我们选定抗原的稀释倍数为1:800（0.625μg/mL），血清最佳稀释倍数为1:100。

2.5 酶标抗体最佳稀释倍数

将羊抗马IgM作1:400稀释包被酶标板，血清1:100稀释，抗原1:800，进行试验。结果表明当酶标抗体1:10000稀释时，阳性对照OD值为1.1左右，且P/N的值最大，因此，酶标抗体最佳稀释倍数为1:104。

2.6 结果判定

对已知的AHSV阳性和阴性血清进行检测，10份阳性血清均P/N≥2.1，30份阴性血清值均P/N＜2.1，根据试验结果，将P/N≥2.1界定为阳性，P/N＜2.1界定为阴性。

2.7 特异性评价

应用建立的捕获ELISA方法对AHSV阳性血清、AHSV阴性血清、马动脉炎阳性血清、马动脉炎阴性血清、马鼻肺炎阳性血清、WEEV阳性血清、WEEV阴性血清进行检测，结果显示，该方法能够检测出AHSV阳性血清（1-9型），特异性高，与其他病毒阳性血清无交叉反应。

2.8 重复性和稳定性评价

应用所建立的捕获ELISA方法进行批内和批间重复试验，计算其变异系数。批内重复试验结果显示变异系数分别为2.31%、1.29%、4.01%；批间重复试验结果显示变异系数为6.21%；结果显示批内和批间的变异系数均小于10%，说明本试验建立的ELISA方法具有较好的稳定性。

2.9 IgM 捕获ELISA与进口试剂盒比较

取180份马血清样品分别用进口试剂盒和本研究建立的捕获ELISA进行检测，结果显示，进口ELISA试剂盒检测出的14份阳性样品中，捕获ELISA检测10份为阳性，4份为阴性；进口ELISA检测166份阴性的样品，捕获ELISA检测170份为阴性。两种ELISA均为阳性的为10份，均为阴性的为166份，因此总符合率为97.7%。

3 讨论

由于非洲马瘟目前在我国还没有疫情发生的报道，因此我国在对该病的防控方面目前还没有具体的措施，也没有自主产权的非洲马瘟疫苗和诊断试剂。为了防止国外疫情传入我国，尽早开展对非洲马瘟诊断试剂的研制，建立简便、快速、特异、灵敏的检测技术，对我国新兴马业的发展具有十分重要的意义。

因为IgM抗体在机体感染后最早出现（7-10天），因而是早期感染的重要标志性抗体。MACELISA是对常规的直接或间接ELISA的重要改进，包被抗IgM抗体的微量板可以捕获样品中所有类型IgM，而不同病原微生物感染仅产生各种特异性的IgM抗体，可结合其自身特异性微生物。在进行MAC-ELISA，只需要加入特定的抗原，就可以检测特定的动物疾病，具有广阔的通用性。而且IgM是早期感染引起的抗体，MAC-ELISA是早期感染诊断的重要工具，早期诊断意义重大，可以迅速采取检疫、防疫措施，避免疫情进一步扩散。

本文通过对抗原浓度、血清稀释度、酶标抗体稀释度等条件进行摸索，最终确定了最佳的反应浓度及稀释度。特异性试验结果显示，本文建立的MAC-ELISA方法仅能检测出AHSV阳性血清，特异性高，与其他病毒阳性血清无交叉反应。重复性及稳定性试验结果显示，批内和批间试验的变异系数均小于10%，说明本试验建立的ELISA方法具有较好的稳定性。在与进口试剂盒进行比对时，进口试剂盒检测出的4份阳性样品，捕获ELISA检测为阴性，且无法用其他方法（如中和试验等）进行验证，存在假阴性的问题，可能与血清采集期有关，感染后期采集的血清中IgM含量会降低。

本文建立的MAC-ELISA方法特异性强，可用于早期病毒感染产生的IgM抗体的检测，且适用范围较广，符合出入境动物检疫、国内疫病疫情快速检测的需要，为早期感染的诊断提供了一种简便、快速、特异、灵敏的检测手段。

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