不同地区商品淫羊藿中朝藿定、淫羊藿苷、总黄酮含量变异及抗氧化活性分析

杨 娟，张华峰，*，牛丽丽，郭 强

（1.教育部药用资源与天然药物化学重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，

陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119；2.西南大学食品科学学院，重庆 400715）

淫羊藿是小檗科淫羊藿属多年生草本植物，经国家卫生部（现国家卫生和计划生育委员会）批准可用于保健食品，在食品和医药工业中具有广泛用途[1-2]。淫羊藿的主要有效成分为黄酮类化合物，大量研究表明淫羊藿总黄酮具有抗氧化、耐缺氧、促进骨骼发育、抗衰老等功效[2]，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C与淫羊藿苷4种黄酮醇糖苷具有抗氧化、防治骨质疏松症等功效[3-4]。《中国药典（2010版）》（以下简称药典）将总黄酮、淫羊藿苷和朝藿定C列为淫羊藿质量评价指标，近年来的研究显示朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷皆为淫羊藿的标志化合物（marker compound）[3-5]。目前世界上已知的淫羊藿种约有57个，其中日本约有5种，地中海和西亚地区约有4种，克什米尔和俄罗斯远东地区各有1种，其余的种属大都分布在我国，因而我国被认为是世界淫羊藿的地理分布中心和物种多样性中心[6-7]。药典规定朝鲜淫羊藿（Epimedium koreanum）、箭叶淫羊藿（E.sagittatum）、心叶淫羊藿（E.brevicornu）、柔毛淫羊藿（E.pubescens）、巫山淫羊藿（E.wushanense）为正品药材，但是市场上实际流通的淫羊藿在10种以上，这使得市售淫羊藿的质量状况变得十分复杂[8]。除了我国以外，日本、韩国、东南亚和地中海等国家与地区也将淫羊藿列为药用植物。作为世界淫羊藿及其提取物的主要出产国，我国所产淫羊藿的质量直接影响着国际市场上药材的品质。因此，系统调查我国市售淫羊藿的品质，测定其中朝藿定、淫羊藿苷和总黄酮的含量，分析其抗氧化活性，对于了解我国商品淫羊藿的质量现状、改善淫羊藿功能性食品的品质具有重要意义。史万忠等[8]测定了市售淫羊藿中淫羊藿苷的含量，王治平等[9]测定了广州地区市售淫羊藿中淫羊藿苷和总黄酮的含量，张俊生等[10]分析了市售箭叶淫羊藿总黄酮提取液对油脂氧化的抑制作用。本研究测定了33批市售淫羊藿样品中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和总黄酮的含量，分析了淫羊藿乙醇提取物的抗氧化活性，以期为淫羊藿的品质鉴定和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Trolox（6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯丙二氢吡喃-2-羧酸）纯度为98%，美国Sigma公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2’-连氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐）美国Sigma公司；淫羊藿苷、朝藿定、抗坏血酸（VC）对照品 纯度≥98%，美国ChromaDex公司；乙腈 HPLC级，美国Fisher公司；甲醇、无水乙醇、冰乙酸和过硫酸钾等 国产分析纯；33批淫羊藿样品 购自我国30多个省、自治区和直辖市，具体信息见表1。

高效液相色谱仪 美国Waters公司；超声波提取器 武汉嘉鹏电子有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；旋涡混合仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；恒温培养箱 上海精密仪器仪表公司；磁力搅拌器 惠智仪诚（北京）科技发展有限公司；离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 淫羊藿的预处理 淫羊藿样品分析之前首先进行分类和清理，去掉土块、羽毛、纸片等杂物，选取叶片并用自来水、蒸馏水依次淋洗，在55℃烘干后粉碎、过筛（80目），再在55℃烘干至恒重，装入带盖离心管中避光保存。

1.2.2 黄酮类化合物的提取 称取0.2g淫羊藿粉末于具塞三角瓶中，加入50%（v/v）乙醇溶液6mL，混匀后在频率30kHz、功率300W、温度50℃下超声波辅助提取30min，共提取3次，提取液合并后用0.45μm有机系滤膜过滤，得到黄酮类化合物样品溶液。若样品溶液不立即进行色谱分析，则置于4℃冰箱避光、密封保存。

1.2.3 朝藿定、淫羊藿苷和总黄酮的定量分析 采用本实验室建立的反相高效液相色谱法[11]同时测定淫羊藿样品溶液中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C与淫羊藿苷的浓度并计算淫羊藿药材中4种标志化合物的含量；采用药典所述紫外分光光度法测定总黄酮含量。每个实验设3个重复求平均值。

1.2.4 乙醇提取液的制备 准确称取淫羊藿粉末0.2g，倾入50mL带盖离心管，加入50%乙醇溶液10mL，拧紧管盖后用旋涡混合仪使溶剂和样品充分混合，静置1h后在90℃水浴锅中温浴提取30min（水浴前后称重，若溶剂有损失则需补足减失的重量），最后用有机系滤膜过滤，所得黄绿色滤液即为乙醇提取液（使用前置4℃冰箱避光保存）。

1.2.5 DPPH自由基清除实验 参考Rao等[12]的方法测定淫羊藿醇提物的DPPH自由基清除率。取0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL，加入装有4mL不同浓度淫羊藿醇提物的具塞试管中，试管封口后在旋涡混合仪上充分混合，然后在37℃水浴中保温30min，取出后在波长517nm处测定吸光度As；用4mL无水乙醇代替4mL醇提物测得吸光度Ab；用抗坏血酸作阳性对照。每个实验重复2次。淫羊藿醇提物的抗氧化活性用DPPH自由基清除率来表示，计算公式为：DPPH自由基清除率（%）=（1-As/Ab）×100。参考李晶晶等[13]的方法计算EC50值。

1.2.6 ABTS+自由基清除实验 参考Kriengsak等[14]的方法测定淫羊藿醇提物的ABTS+自由基清除率。将0.0626g Trolox溶于25mL无水乙醇中配制成浓度为10mmol/L的母液，再用无水乙醇稀释成浓度依次为50、100、150、200、250、300、350、400μmol/L的梯度溶液。分别取250μL不同浓度梯度溶液，各加入4750μL的ABTS+自由基溶液，在30℃水浴中避光反应6min后在734nm波长处测定吸光度As；对照组用250mL 50%乙醇溶液代替250mL Trolox溶液测得吸光度Ab；实验组用250μL淫羊藿醇提物代替250mL Trolox溶液测定吸光度As。每个实验重复2次。以Trolox溶液的浓度为X轴、Trolox对ABTS+自由基的清除率为Y轴绘制标准曲线（Y=0.2514X+2.2052，相关系数R2=0.9942），以Trolox为参照物计算淫羊藿醇提物的抗氧化活性和EC50值。ABTS+自由基清除率的计算公式为：ABTS+自由基清除率（%）=（1-As/Ab）×100。

2 结果与分析

2.1 淫羊藿黄酮类化合物的含量

由表1可知，不同地区商品淫羊藿中黄酮类化合物的含量差异很大，变异系数在29.76% ～87.79%之间。其中，四川成都的朝藿定A含量最高（3.01mg/g），黑龙江哈尔滨最低（0.37mg/g）；上海的朝藿定B含量最高（5.22mg/g），黑龙江哈尔滨最低（0.25mg/g）；福建三明的朝藿定C含量最高（19.27mg/g），宁夏吴忠最低（0.46mg/g）；上海的淫羊藿苷含量最高（13.40mg/g），黑龙江哈尔滨最低（0.41mg/g）；上海的总黄酮含量最高（68.73mg/g），宁夏吴忠最低（18.29mg/g）。药典规定总黄酮含量不得低于50mg/g，淫羊藿苷不低于5mg/g，朝藿定C不低于10mg/g。然而，33批市售淫羊藿样品中仅上海、福建三明等8个地区的总黄酮含量达到药典要求，达标率为24.2%；上海、天津等14个地区的淫羊藿苷含量达到药典要求，达标率为42.4%；福建三明、重庆等6个地区的朝藿定C含量达到药典要求，达标率为18.2%。按照药典对总黄酮、淫羊藿苷和朝藿定C的要求，药材合格率为30.3%。可以看出，大多数市售淫羊藿样品的质量较差。史万忠等[8]和王治平等[9]也发现市售淫羊藿中淫羊藿苷与总黄酮的含量大都没有达到药典要求。笔者在文献调研[8-9，15]和实验研究的基础上统计了2001 ～2013年市售淫羊藿药材合格率的数据，发现近十年来国内市场淫羊藿药材的质量呈缓慢下降趋势（图1）。造成这种现象的原因可能是淫羊藿药材的种植、采摘、收购环节中缺少必要的检测和有效的监管。大量研究显示，淫羊藿体内黄酮类化合物的积累过程既受到遗传因素的影响[4]，又受到环境因素（包括采摘时期、土壤、光照、气温、降水量等）的影响[15-18]。如果在种植和采摘环节中忽视品种和收获季节的选择，或者在收购环节中忽视品种的鉴定（含伪品的甄别）和标志化合物的检测，都可能使药材质量大打折扣。

表1 不同地区商品淫羊藿中黄酮类化合物的含量Table 1 Contents of flavonoids in Epimedii Folium in different areas of China

图1 不同年份市售淫羊藿质量状况Fig.1 Current status of quality of Epimedii Folium in different years

从表1还可看出，淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷4种标志化合物的含量不存在消长关系即各自含量没有相关性，例如甘肃兰州市售淫羊藿中淫羊藿苷含量虽然较低（3.26mg/g），但是朝藿定C含量却很高（11.55mg/g），而黑龙江哈尔滨的淫羊藿苷和朝藿定B含量均较低（0.41mg/g和0.25mg/g）。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的功效不尽相同[4]，单纯以淫羊藿苷或朝藿定C作为评价指标不能全面反映淫羊藿的内在品质[2]。遗憾的是，虽然将朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷4种黄酮醇糖苷作为淫羊藿的标志化合物已经成为很多学者的共识[3-5，19]，但是药典至今尚没有关于朝藿定A和朝藿定B的含量标准，在一定程度上影响了淫羊藿的质量控制。

2.2 淫羊藿的抗氧化活性

由表2可知，不同地区商品淫羊藿醇提物的抗氧化活性差异很大。在ABTS实验中，以Trolox溶液浓度为X轴、Trolox对ABTS+的清除率为Y轴绘制标准曲线（Y=0.2514X+2.2052，相关系数R2=0.9942），计算出淫羊藿醇提物的EC50值在4.71 ～21.96μg/mL之间，其中黑龙江哈尔滨地区市售淫羊藿的ABTS+·清除能力最强（4.71μg/mL），福建三明最弱（21.96μg/mL）；在DPPH自由基清除实验中，EC50值的范围在0.27 ～3.51μg/mL之间，其中湖南邵阳地区市售淫羊藿的自由基清除能力最强（0.27μg/mL），山西清徐最弱（3.51μg/mL），所有淫羊藿样品的DPPH自由基清除率均高于VC。相关性分析表明，淫羊藿醇提物的抗氧化活性与朝藿定C、总黄酮含量的相关性较高，而与朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷含量的相关性较低（表3）。这说明，朝藿定C是淫羊藿中抗氧化活性较强的黄酮类化合物，但并非唯一的抗氧化物质，在淫羊藿中很可能还存在着其他一些抗氧化活性较强的化合物。尽管ABTS实验与DPPH实验得出的R2数据不同，但是黄酮类化合物与抗氧化活性相关性的整体趋势相似，这可能是由于DPPH与ABTS实验的反应机制不同，而反映的抗氧化活性本质基本一致。

表2 不同地区商品淫羊藿醇提物的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of alcoholic extracts of Epimedii Folium in different areas of China

表3 淫羊藿黄酮类化合物与抗氧化活性的相关性Table 3 Relationship between antioxidant capacities and flavonoids in Epimedii Folium

3 结论

本研究系统测定了不同地区商品淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷与总黄酮的含量及其DPPH·、ABTS+·清除能力。结果表明，不同地区淫羊藿中黄酮类化合物的含量变异较大，抗氧化活性也存在较大差异，药材质量参差不齐。淫羊藿的抗氧化活性与朝藿定C、总黄酮含量的相关性较高，而与朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷含量的相关性较低。淫羊藿黄酮类化合物的含量变异与抗氧化活性分析为其品质鉴定和质量控制提供了依据，同时也为淫羊藿功能性食品的生产提供了参考。

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