角膜组织块培养法建立ICR小鼠蚕蚀性角膜溃疡体外模型

闫 莹，朱孔梅，杨 鉴，姚景春

（1.临沂市人民医院眼科，山东临沂 276000；2.中药制药共性技术国家重点实验室，鲁南制药集团股份有限公司新药药理中心，山东临沂 273400）

蚕蚀性角膜溃疡在临床上比较常见，但病因尚没有完全研究清楚，多数学者认为该病可能是体液免疫为主、细胞免疫为辅的自身免疫性疾病。免疫抑制剂或者联合球结膜切除术具有一定的效果［1－2］，具有免疫抑制或免疫干预活性的中药有效成分可能会是治疗蚕蚀性角膜溃疡的潜在有效药物，但动物筛选模型的匮乏成为此类药物研发的制约环节。角膜缺乏血液循环，白细胞能够浸润到角膜组织的难度较大，因此，相关免疫性损伤的动物模型制作困难。故本试验尝试使用在体外将小鼠角膜细胞和自身白细胞共培养的方法，通过观察小鼠角膜细胞体外生长情况，建立蚕蚀性角膜溃疡的体外动物模型，可为研发治疗该疾病的药物打下基础。

1 材料

1.1 动物及分组 SPF级ICR小鼠，♀♂各半，体质量（20±2）g，鲁南制药集团股份有限公司实验动物中心提供，合格证号：0015255。随机分成3组，设正常对照组、皮下免疫组、环磷酰胺给药组，每组10只。饲养于屏障环境。1.2 主要试剂及仪器 曲拉通（国药集团化学试剂有限公司，S20120321），生理盐水（辰欣药业股份有限公司，1201228202），完全弗氏佐剂（中国兽医药品监察所，201201），环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，12041825），戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，P3761），RPMI 1640细胞培养液（Gibco，1204685），CKX31显微镜（OLYMPUS），BB15培养箱（THERMO），FHS-2型可调高速匀浆器（江苏荣华）。

2 方法

2.1 动物造模方法 取兔眼角膜，剪碎后，加入5～10倍体积的5%曲拉通溶液，高速匀浆至无块状颗粒，将匀浆液3 000 r·min－1离心10 min，取上清液。将5 ml上清液与5 ml完全弗氏佐剂剧烈震荡混合制成混合液。皮下免疫组和环磷酰胺给药组每只小鼠背部皮下注射混合液0.5 ml，隔日注射1次，连续注射10次，正常对照组不注射混合液。在皮下免疫的同时，正常对照组与皮下免疫组背部皮下注射生理盐水0.5 ml／只，环磷酰胺给药组背部皮下注射环磷酰胺300 mg·kg－1，给药部位与注射混合液部位不重叠。

2.2 角膜组织块体外培养 末次给药3 d后，小鼠采血后处死，摘取眼球，在解剖显微镜下小心剥离眼角膜，将小鼠的角膜剪碎，注意无菌操作和剪取的角膜大小一致。将角膜与自身血液中分离的白细胞在24孔培养板中共同培养，每只小鼠的角膜设4个复孔，24 h换液1次，仔细观察小鼠眼角膜组织块状态与角膜细胞的长出情况。

3 结果

每孔角膜细胞的长出率使用SPSS软件进行χ2检验。正常对照组小鼠眼角膜细胞72 h和120 h长出率分别为25.0%和37.5%，皮下免疫组均为0.0%，明显低于正常对照组（P＜0.01），环磷酰胺给药组长出率分别为12.5%和17.5%，明显高于皮下免疫组（P＜0.05）。具体结果见Tab 1。

Tab 1 Growth of cornea cell in serum free cornea explants culture

4 讨论

蚕蚀性角膜溃疡是一种自身免疫性疾病，在病因或者遗传方面还没有完全研究清楚［3］，患者体内存在抗角膜基质中自身免疫性抗原的抗体［4］。患者角膜溃疡处和相邻的结膜有大量的巨噬细胞和T淋巴细胞浸润，同时溃疡角膜和相邻结膜上皮异常高表达VCAM-1［5］。给小鼠皮下注射含有新西兰兔角膜胶原蛋白的佐剂，可通过分子模拟，打破小鼠对自身角膜胶原蛋白的免疫耐受，引起自身反应性T、B淋巴细胞的扩增，进一步引起角膜的免疫损伤。我们通过多次试验，仍然观察不到皮下免疫ICR小鼠的自身免疫性角膜损伤，因而无法成功制备蚕蚀性角膜溃疡模型，这可能与角膜细胞很难与血液循环中的淋巴细胞接触有关。

为了将自身反应性淋巴细胞与角膜细胞有效地接触，本实验将小鼠白细胞与自身角膜细胞共培养，观察角膜的生长情况。发现正常对照组小鼠眼角膜上皮细胞120 h后长出率可达37.5%，而皮下免疫组长出率为0.0%，说明针对自身角膜的自身反应性淋巴细胞在与角膜共培养的过程中，对角膜细胞产生了免疫性损伤，成功模拟到蚕蚀性角膜溃疡的免疫损伤。环磷酰胺给药组角膜细胞长出率为17.5%，明显高于皮下免疫组，这与临床上免疫抑制剂治疗蚕蚀性角膜溃疡有一定效果相吻合［1－2，6－7］。

中药是免疫干预活性有效成分的天然宝库，有很多的成分等待我们去挖掘发现，本文所建立的体外模型，将会促进中药有效成分的筛选与开发。

参考文献：

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