黄芪甲苷对Th2型淋巴细胞D10.G4.1体外作用的研究

金华良，王利民，罗清莉，厉 蓓，杜懿杰，吕玉宝，董竞成

（1.南京医科大学附属杭州医院呼吸科，浙江 杭州 300021；2.复旦大学附属华山医院中西医结合科，上海 200041）

Th2细胞因子在过敏性疾病（如哮喘）中发挥重要作用。研究证实其可促进B细胞分泌IgE，嗜酸性细胞聚集及气道上皮粘液分泌，是气道炎症产生的主要机制［1］。黄芪甲苷属于三萜皂苷类药物，是传统益气类中药黄芪的的主要活性成分，也是黄芪质量控制的标准。本课题组前期发现黄芪可抑制哮喘模型 IL-4、IL-5、IL-13水平，改善气道炎症［2］。研究证实黄芪甲苷具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗纤维化等作用，对哮喘气道炎症及重塑均有较好的改善作用［3］。本课题组推测黄芪甲苷可抑制Th2型反应，但目前报道多为对脾淋巴细胞等模型的干预研究。本研究采用D10.G4.1（D10）淋巴细胞，其为目前公认的Th2淋巴细胞株，旨从细胞水平探讨黄芪甲苷对Th2型反应的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料 D10细胞株来源：购于美国ATCC公司，货号：TIB-224TM；黄芪甲苷（纯度：＞99%）购于上海融禾医药科技发展有限公司；地塞米松注射液由山东新华制药股份有限公司提供；刀豆素蛋A（concanavalin A，ConA）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）购于美国 Sigma公司；RPMI 1640完全培养液、胎牛血清、2-巯基丙醇购自美国Gibco公司；TSTIM购于美国BD公司；小鼠IL-1α购于美国R＆D公司；细胞增殖-毒性检验试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购自日本同仁化学研究所；IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒购于上海西唐生物医药公司；gata-3兔抗小鼠多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 ① 空白组：将D10细胞予完全培养基中培养，予培养基对照处理。② ConA组：将D10细胞予完全培养基中培养，予以50 mg·L－1ConA。③地塞米松（Dex）组：将D10细胞予完全培养基中培养，予以10－8mol·L－1Dex。④、⑤、⑥ 黄芪甲苷低、中、高剂量组：将D10细胞予完全培养基中培养，予以 50 mg·L－1ConA，及分别为 2、4、8×10－5mol·L－1黄芪甲苷。

1.2.2 D10细胞株培养条件 RPMI 1640培养基，10%T-STIM和 Con A，10% 胎牛血清，0.05 mmol·L－12-巯基丙醇，10 ng·L－1小鼠 IL-1α，在 37.0℃，5%CO2条件下培养。

1.2.3 CCK-8法检测细胞毒性及细胞增殖 细胞毒性实验：无菌条件下，向96孔培养板中依次加入D10细胞悬液，使每孔细胞数为104，再加入黄芪甲苷（使终浓度为2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（终浓度为10－8mol·L－1）或等体积培养基，共孵育48 h。最后加入10μl CCK-8试剂，37℃孵育3 h。

细胞增殖实验：先用黄芪甲苷（使终浓度分别为2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（终浓度为10－8mol·L－1）或等体积培养基预处理D10细胞2 h，然后每孔加入 ConA（终浓度为 50 mg·L－1），共刺激48 h。最后加入10μl CCK-8试剂，37℃孵育3 h。最后采用酶标仪测定吸光度值，读取波长为570 nm。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡与周期 无菌条件下，向12孔培养板中依次加入D10细胞悬液，使每孔细胞数为106，加入黄芪甲苷（使终浓度分别为2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（终浓度为 10－8mol·L－1）或等体积培养基预处理2 h。再加入ConA（终浓度为 50 mg·L－1），共刺激 48 h后，收集细胞悬液。1 000 r·min－1离心收集细胞。冰70%乙醇4℃固定2 h。离心细胞去除乙醇，用PBS洗1遍。加PI染色液放置1 h后上流式细胞仪，检测细胞凋亡比例及细胞周期。

1.2.5 ELISA检测D10细胞培养上清细胞因子

无菌条件下，向24孔培养板中依次加入D10细胞悬液，使每孔细胞数为105，加入黄芪甲苷（使终浓度分别为2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（终浓度为10－8mol·L－1）或等体积培养基预处理 2 h。再加入ConA（终浓度为50 mg·L－1），共刺激48 h后，收集细胞悬液，1 500 r·min－1，5 min，收集细胞上清液，采用 ELISA法测定 IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α水平，具体操作参照厂家说明书进行。

1.2.6 Western blot测定D10细胞gata-3表达水平

无菌条件下，向6孔培养板中依次加入D10细胞悬液，使每孔细胞数为2×106，加入黄芪甲苷（使终浓度分别为2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（终浓度为10－8mol·L－1）或等体积培养基预处理2 h。再加入ConA（终浓度为50 mg·L－1），共刺激48 h后，收集细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。灌注凝胶，上样，电泳60V×30 min后改用80 V恒压电泳；300 mA恒流转膜90 min；封闭2 h；加入TBST稀释的gata-3抗体，4℃过夜；加羊抗兔二抗，室温2 h；ECL显色后将滤膜在暗室曝光后显影，定影，使用Quantity One软件进行条带光密度值扫描。以β-actin作内参对照。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，数据采用¯x±s表示，凡符合方差齐性的数据，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较采用Dunnett法。对不符合方差齐性的数据，则进行秩和检验（Kruskal-Wallis法），多组间两两比较采用Mann-Whiteney-U法。

Fig 1 Effects of AS and／or ConA on D10 cell viability＃P＜0.05 vs blank group；*P＜0.05 vs ConA group

2 结果

2.1 黄芪甲苷对D10淋巴细胞体外增殖的影响细胞毒性实验结果显示，培养48h后，地塞米松可明显抑制D10细胞活性（P＜0.05），而不同浓度的黄芪甲苷（2、4、8×10－5mol·L－1）对 D10细胞活性无明显影响（P＞0.05）；加入 5 mg·L－1ConA刺激后，细胞活性明显提高（P＜0.05）；地塞米松可明显抑制ConA诱导的细胞增殖（P＜0.05）；不同浓度的黄芪甲苷（2、4、8×10－5mol·L－1）对 D10细胞活性无明显影响（P＞0.05）。见Fig 1。

2.2 黄芪甲苷对D10细胞体外凋亡和细胞周期的影响 结果显示，ConA组凋亡较正常组明显减少（P＜0.05）；地塞米松组较ConA组细胞凋亡明显增多（P＜0.05），G0／G1期细胞比例明显增加（P＜0.01），而 S期和G2／M期细胞比例明显减少（P＜0.01）。黄芪甲苷低、中、高剂量组D10细胞G0／G1期、S期均无明显变化（P＞0.05），而高剂量组G2／M期细胞比例较ConA组明显减少（P＜0.05）。以上说明黄芪甲苷在本实验浓度内对D10细胞无明显的促凋亡作用，但高剂量组对细胞周期有一定影响。见 Fig 2、3，Tab 1。

Fig 2 Representative plots of flow cytometry of cycle distribution

Fig 3 Effects of AS on apoptosis of D10 cells＃P＜0.05 vs blank group；*P＜0.05 vs ConA group.

2.3 黄芪甲苷对培养上清中细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α）的影响 结果显示，培养48 h后，ConA组较正常组IL-4、IL-5、IL-13及TNF-α水平均明显升高（P＜0.05），地塞米松组 IL-4、IL-5、IL-13及TNF-α水平明显下降（P＜0.05，P＜0.01）；黄芪甲苷高剂量组可明显下降D10细胞培养上清中IL-13水平（P＜0.01），而低剂量组TNF-α水平明显下降（P＜0.01）。但黄芪甲苷各剂量组对 IL-4、IL-5水平无明显影响（P＞0.05）。见Fig 4。

2.4 黄芪甲苷对D10细胞gata-3表达水平的影响

结果显示，ConA组较空白组gata-3表达水平明显增加（P＜0.05）；而地塞米松组gata-3表达水平明显降低（P＜0.05）；黄芪甲苷高剂量组gata-3表达水平较ConA组明显下降（P＜0.05），而低、中剂量组无明显差异（P＞0.05）。见Fig 5。

Tab 1 Effect of ASon cycle distribution of D10 cells

3 讨论

现代药理学研究表明，黄芪甲苷具有良好的免疫调节作用，可抗炎、抗氧化、抗病毒等作用［4－6］。哮喘是Th2淋巴细胞等介导的气道炎症性疾病。既往的研究［7］提示黄芪甲苷可调节T、B淋巴细胞增殖，但罕见对Th2型淋巴细胞作用的相关报道。因此，本研究通过探讨黄芪甲苷体外干预Th2淋巴细胞株（D10细胞）的作用，进一步阐明黄芪甲苷对哮喘等疾病的作用机制，为临床应用奠定理论基础。

为探讨黄芪甲苷是否存在细胞毒性作用，本研究首先检测药物对细胞活性的影响。结果发现，在有、无ConA刺激时，黄芪甲苷在本实验浓度下（2、4、8×10－5mol·L－1）对 D10细胞活性均无明显影响，说明在本实验浓度下，黄芪甲苷对D10细胞无细胞毒性作用。地塞米松在有、无ConA刺激的条件下，均可明显抑制D10细胞的活性，说明本实验浓度下的地塞米松（10－8mol·L－1），对 D10细胞具有一定的细胞毒性。

Fig 4 Effects of ASon cytokines in culture supernatants of D10 cells＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ConA group

Fig 5 Effects of AS on gata-3 expression of D10 cells＃P＜0.05 vs blank group；*P＜0.05 vs ConA group.

凋亡和细胞周期的检测可进一步分析药物对细胞增殖的影响。本研究发现，与ConA组比较，低、中、高剂量组黄芪甲苷对D10细胞凋亡均无明显影响，进一步证实本实验浓度下黄芪甲苷对D10细胞无细胞毒性。但黄芪甲苷高剂量组G2／M期细胞比例明显减少，说明一定剂量的黄芪甲苷可减缓细胞的有丝分裂。而地塞米松组D10细胞凋亡明显增加，G0／G1期的细胞比例时间明显上调，而S与G2／M期的细胞比例明显减少，提示地塞米松可以抑制D10细胞内DNA合成，促使细胞停滞在静止期。

IL-4、IL-5及IL-13是经典的Th2型淋巴细胞因子，也是哮喘气道炎症的主要炎症介质［8］。研究已证实黄芪甲苷可抑制气道炎性因子水平，减少嗜酸性粒细胞聚集，从而改善气道炎症［9］。本课题从体外研究发现，黄芪甲苷对Th2型细胞因子IL-4及IL-5水平无明显影响，但可明显抑制IL-13水平。IL-13在哮喘发病机制中发挥多种功能，可促进气道粘液分泌，加重气道炎症及气道高反应性［10］。此外，本研究还发现，低剂量组黄芪甲苷可抑制TNF-α水平。TNF-α可以促进嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的募集，促进T细胞活化，上调黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达，从而加重哮喘气道炎症［11］。以上提示黄芪甲苷体内改善哮喘气道炎症，其作用可能与抑制Th2细胞IL-13及TNF-α水平相关。本实验中，地塞米松组IL-4、IL-5、IL-13及 TNF-α水平明显下降，但其作用可能与其明显抑制D10细胞活性相关。

为进一步分析黄芪甲苷对D10细胞的作用，本研究检测了gata-3表达的变化。gata-3是Th2淋巴细胞分化成熟的关键转录因子，对Th2型细胞因子水平具有重要影响。本研究发现，黄芪甲苷高剂量组可明显抑制gata-3表达。研究认为gata-3可调控IL-13基因的转录表达，与其蛋白表达水平密切相关［12］。因此，黄芪甲苷降低IL-13水平，可能与其抑制gata-3水平相关。gata-3表达水平对IL-4、IL-5细胞因子也具有重要影响，但本实验中黄芪高剂量组IL-4及IL-5水平与ConA组无明显差异。一方面，细胞因子的表达水平受细胞内、外环境的影响，本实验采用ConA为促有丝分裂原，可选择性刺激T细胞增殖，因此IL-4及IL-5水平升高与D10细胞增殖密切相关，而gata-3水平的变化并未影响ConA促进细胞因子（IL-4及IL-5）的表达。黄芪甲苷可抑制IL-13水平，推测除抑制gata-3外，可能存在其它作用机制，有待进一步研究证实。另一方面，gata-3对IL-4及IL-5的调节首先表现在转录水平，故而进一步实验可检测黄芪甲苷对IL-4及IL-5mRNA水平的影响。

综上，本研究证实黄芪甲苷体外具有抑制Th2反应的作用，这可能是黄芪甲苷治疗哮喘的作用基础。至于黄芪甲苷调节gata-3表达机制，有待进一步研究。

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