柯萨奇病毒B3感染HeLa细胞后Bax和Bim的表达*

杨 丽， 李 欣， 田 朗， 黄利华， 李卓颖， 杨作成

(中南大学湘雅三医院儿科，湖南长沙 410013)

柯萨奇病毒B3感染HeLa细胞后Bax和Bim的表达*

杨 丽， 李 欣， 田 朗， 黄利华， 李卓颖， 杨作成△

(中南大学湘雅三医院儿科，湖南长沙 410013)

目的：观察HeLa细胞感染柯萨奇病毒B3(CVB3)后Bax和Bim mRNA和蛋白的表达。方法：将HeLa细胞分为未予以CVB3感染的对照组和予以CVB3感染的病毒组，取3 h、6 h、9 h、12 h和24 h的细胞，采用RT-PCR和Western blotting分别检测Bax和Bim mRNA和蛋白的表达。结果：Bax和Bim mRNA在对照组和病毒组HeLa细胞中均有表达，在病毒组和对照组中Bax和Bim mRNA的表达在各自组内均无显著差异(P＞0.05)，但在24 h Bax和Bim在病毒组mRNA的表达低于对照组(P＜0.05)。Bax和Bim蛋白表达在对照组中各时点均有表达，但无显著差异(P＞0.05)。病毒组Bax蛋白在24 h表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，且病毒组表达明显低于对照组(P＜0.05);Bim蛋白的表达随感染时间延长而下降(P＜0.05)，9 h、12 h和24 h表达病毒组低于对照组(P＜0.05)。结论：Bax和Bim在CVB3感染诱导的HeLa细胞凋亡早期发挥作用。

HeLa细胞;柯萨奇病毒B3;细胞凋亡;Bax蛋白;Bim蛋白

引起病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)的病毒众多，而以柯萨奇病毒 B3(coxsackievirus B3，CVB3)引起的病毒性心肌炎较常见［1-2］。研究发现，VMC的发病与病毒感染所造成的直接损伤和感染后引起的机体免疫紊乱有关［3-4］。近年研究发现心肌细胞的凋亡也参与了VMC的发生、发展［5-6］，认为细胞凋亡也是VMC的发病机制之一。参与细胞凋亡的信号通路及基因家族有多种，Bcl-2家族与细胞凋亡密切相关，它具有双重效应，即具有促进凋亡的作用，也起到抗细胞凋亡的效应［7］，其中Bim和Bax属于该家族促进细胞凋亡成员。本研究以CVB3感染Hela细胞后，观察促凋亡成员Bax和Bim mRNA和蛋白表达及变化，探讨促凋亡因子在细胞凋亡中是否发挥作用。

材料和方法

1 材料与试剂

人宫颈癌细胞株HeLa由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所惠赠。CVB3 Nancy株由本实验室保存传代［8］。采用微量法测定其半数组织感染量(TCID50)。逆转录试剂盒由 Toyobo生产;Trizol总RNA抽提试剂盒及胰蛋白酶由Gibco生产;改良型RPMI-1640培养基及胎牛血清由Hyclone生产;PCR Master Mix及Marker I购自北京天根生化科技有限公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;Bax和Bim蛋白多克隆抗体由Cell Signaling Technology生产;蛋白裂解液及聚丙烯酰胺凝胶试剂购自北京碧云天生化科技有限公司。

2 主要方法

2.1 实验分组 以2×108/L的密度将HeLa细胞均匀地接种于6孔板中，予10%胎牛血清培养基培养24 h，待细胞贴壁处于对数生长期时，以无血清RPMI-1640培养基饥饿过夜，随机设立对照组和病毒组。

2.2 CVB3感染HeLa细胞模型的建立 根据Reed-Muench法计算病毒滴度，选取2×100 TCID50病毒浓度(2×10-2)接种细胞。将6孔板中培养的HeLa细胞按照上述实验方法随机设立对照组及病毒组。以无血清培养基漂洗2次，对照组加入1 mL含2%胎牛血清的病毒维持液，病毒组加入1 mL病毒液。将6孔板置于5%CO2、37℃培养箱中孵育1 h之后弃去6孔板中所有液体，然后加入病毒维持液2 mL，分别于加入病毒后3 h、6 h、9 h、12 h和24 h观察细胞病变效应及提取RNA和蛋白。

2.3 RT-PCR检测CVB3感染后HeLa细胞中凋亡相关基因的表达 采用Trizol试剂盒提取CVB3感染后不同时点对照组与病毒组的总RNA，然后按照逆转录试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA，进行PCR产物扩增。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.4 Western blotting检测CVB3感染后HeLa细胞中凋亡相关蛋白的表达 用蛋白裂解液在冰上裂解CVB3感染后不同时点对照组与病毒组的HeLa细胞，获取全细胞裂解液，检测蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，放入5%脱脂牛奶4℃冰箱封闭过夜，加Ⅰ抗置于匀速摇床孵育3 h后漂洗，然后加入脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温反应2 h后漂洗，化学发光底物显色，胶片曝光，扫描。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 CVB3感染HeLa细胞后Bax mRNA的表达

对照组内不同时点比较，Bax mRNA的表达量差异均无统计学意义(P＞0.05);病毒组内不同时点比较，Bax mRNA的表达量也无显著差异(P＞0.05);对照组与病毒组比较，在3 h、6 h、9 h和12 h各时点差异均无统计学意义(P＞0.05)，但病毒组24 h Bax mRNA表达低于对照组(P＜0.05)，见图1、表2。

Figure 1.The mRNA expression of Bax in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.图1 不同时点病毒组与对照组HeLa细胞内Bax mRNA的表达

表2 不同时点CVB3感染HeLa细胞对Bax mRNA表达的影响Table 2.The relative mRNA expression levels of Bax in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean± SD.n=4)

2 CVB3感染HeLa细胞后Bax蛋白的表达

对照组内不同时点比较，Bax蛋白表达无显著差异(P＞0.05);病毒组Bax蛋白在24 h表达降低，与各时点比较差异显著(P＜0.05)，而3 h、6 h、9 h和12 h各时点比较无显著差异(P＞0.05);对照组与病毒组间比较，3 h、6 h、9 h和12 h时点Bax蛋白表达均无显著差异(P＞0.05)，但病毒组24 h的Bax蛋白表达低于对照组(P＜0.05)，见图2、表3。

Figure 2.The protein expression of Bax in control group and CVB3-infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.图2 不同时点CVB3感染HeLa细胞及对照组细胞内Bax蛋白的表达

表3 不同时点CVB3感染HeLa细胞对Bax蛋白表达的影响Table 3.The protein levels of Bax in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean±SD.n=3)

3CVB3感染HeLa细胞后Bim mRNA的表达

对照组内不同时点比较，Bim mRNA的表达量差异均无统计学意义(P＞0.05);病毒组内不同时点比较，Bim mRNA的表达量差异也均无统计学意义(P＞0.05);对照组与病毒组间比较，3 h、6 h、9 h和12 h时点无显著差异(P＞0.05)，但24 h时点病毒组Bim mRNA表达低于对照组(P＜0.05)，见图3、表4。

Figure 3.The mRNA expression of Bim in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.图3 不同时点病毒组与对照组HeLa细胞内Bim mRNA的表达

表4 不同时点CVB3感染HeLa细胞及对Bim mRNA表达的影响Table 4.The relative mRNA expression levels of Bim in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean±SD.n=4)

4 CVB3感染HeLa细胞后Bim蛋白的表达

对照组内不同时点比较，Bim蛋白表达无显著差异(P＞0.05);病毒组3 h与6 h、及9 h与12 h时点比较均无显著差异(P＞0.05)，3 h和6 h Bim蛋白表达均较9 h、12 h和24 h高(均P＜0.05)，24 h的Bim蛋白表达较9 h和12 h明显降低(P＜0.05);对照组与病毒组比较，3 h和6 h的Bim蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)，在9 h、12 h和24 h Bim蛋白表达较对照组降低(P＜0.05)，尤以24 h时点下降明显，见图4、表5。

Figure 4.The protein expression of Bim in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.图4 不同时点病毒组与对照组HeLa细胞内Bim蛋白的表达

表5 不同时点CVB3感染HeLa细胞对Bim蛋白表达的影响Table 5.The protein expression of Bim in CVB3-infected HeLa cells and the control cells at different time points(Mean±SD.n=3)

讨论

VMC是由嗜心肌病毒感染引起的以局限性或弥散性心肌炎症病变为主的疾病，是儿科临床较常见的心血管疾病之一，近年来其发病率有所上升［9］。病毒感染不但可直接导致心肌细胞损伤，还可激活如Bcl-2家族、caspase家族等启动心肌细胞凋亡，致心肌细胞损伤、心功能减退，并且心肌损伤程度和病毒毒力有关。细胞凋亡与多种疾病的发生和发展有关［10］，在人类正常的心脏中可以出现细胞凋亡，而细胞凋亡的异常在心血管疾病的发病中也起着重要作用［11］，如心肌病、冠心病及高血压病等。研究报道心肌炎患者心肌细胞中存在细胞凋亡异常，提示凋亡可能是心肌损害的机制之一。后来陆续证实细胞凋亡参与VMC的发生与发展［5，12-14］。

Bcl-2家族是与细胞凋亡密切相关的家族，在调控细胞凋亡的过程中发挥关键作用［15］，根据其作用机制可分为两类:一类抗凋亡成员包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等;另一类促凋亡成员包括Bax、Bad、Bim等［7］。抗凋亡与促凋亡成员协同作用，在凋亡过程中发挥开关效应。Bax是Bcl相关X蛋白，广泛表达于心脏等各种组织中，过度表达可加速细胞凋亡。Bax不但有拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且可直接促进细胞凋亡。韩波等［16］发现CVB3感染心肌细胞后可使心肌细胞过量表达Bax，诱导心肌细胞凋亡。曾娅莉等［17］发现Bax mRNA表达在辛伐他汀干预K562细胞24 h后随时间的延长其表达增高。本研究发现，CVB3感染HeLa细胞后Bax mRNA表达在3 h、6 h、9 h、12 h和24 h各时点均有表达，且24 h内Bax mRNA表达无增强或减弱的变化。同时通过观察到CVB3感染HeLa细胞后Bax蛋白在各时点均有表达，在3 h、6 h、9 h和12 h Bax蛋白表达无明显变化(P＞0.05)，至24 h蛋白表达明显下降，与各时点比较有显著差异(P＜0.05)。在病毒组Bax蛋白的表达中，12 h内Bax蛋白表达不随时间的延长而变化，但在24 h蛋白表达明显减弱，表明Bcl-2促凋亡成员Bax在病毒感染后的早期即促使细胞发生凋亡，但随病毒感染时间的延长，促凋亡效应反而减弱，更证明Bcl-2家族凋亡成员的促凋亡作用在早期发挥作用。

Bim是一种与Bcl-2相互作用的仅含1个同源BH3结构域的促凋亡基因，其可直接激活BH3域被认为是细胞凋亡起始的必需因子，可通过抑制死亡因子或启动促凋亡蛋白功能，导致细胞色素C自线粒体向细胞浆的释放，启动caspase，进而诱发细胞凋亡，也能以不依赖于细胞色素C的方式启动caspase，如通过caspase启动因子Apaf-1等来诱发细胞凋亡。曾有报道它可直接激活Bax和Bak，Bim缺失可触发抗凋亡效应［18］。本实验发现，在CVB3病毒感染后Bim mRNA表达在3 h、6 h、9 h、12 h和24 h各时点均有表达，且24 h内Bim mRNA表达无增强或减弱的变化，与Bax mRNA变化趋势基本一致。在病毒感染后Bim蛋白在各时点均有表达，呈逐渐下降的趋势，最初的3 h和6 h Bim蛋白表达无明显差异，9 h至12 h开始出现蛋白表达下降，但9 h与12 h无差异，至24 h Bim蛋白表达明显下降，且24 h与各时点比较均有显著差异。李小平等［19］发现，CVB3感染HeLa细胞4 h后细胞发生凋亡，呈时间依赖性增高，24 h后较多HeLa细胞出现凋亡改变，但在晚期凋亡细胞中可能存在坏死的细胞，导致促凋亡基因及蛋白表达降低。本实验发现，CVB3病毒感染HeLa细胞后Bax和Bim mRNA在24 h内各时点均有表达，但各时点间均无显著差异(P＞0.05)。Bim蛋白表达在病毒感染早期较高，随感染时间的延长出现逐渐下降趋势，至24 h明显下降，而Bax在12 h蛋白表达无显著变化，至24 h明显下降，可见Bax蛋白表达与Bim蛋白表达趋势也基本一致，均是在24 h表达明显减弱。

由此可知，在CVB3感染HeLa细胞模型中，Bcl-2家族促凋亡成员Bax和Bim均能发挥促凋亡作用，使HeLa细胞发生凋亡，且均在病毒感染早期就开始发挥促凋亡作用，该作用贯穿细胞死亡的始终，只是随病毒感染时间的延长，因其它促使细胞死亡的形式可能逐渐超过细胞凋亡的作用，而导致促凋亡因子的表达反而随时间的延长出现降低的现象，故提示促凋亡因子Bax和Bim在CVB3诱导的细胞凋亡中发挥作用。

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Expression of Bax and Bim in coxsackievirus B3-infected HeLa cells

YANG Li，LI Xin，TIAN Lang，HUANG Li-hua，LI Zhuo-ying，YANG Zuo-cheng
(Department of Pediatrics，Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410013，China.E-mail:yang_ zcr@126.com)

AIM:To observe the expression of Bax and Bim at mRNA and protein levels in coxsackievirus B3 (CVB3)-infected HeLa cells.METHODS:HeLa cells were divided into control(non-CVB3 infection)group and CVB3 infection group.The expression of Bim and Bax at mRNA and protein levels was determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blotting analysis at 3 h，6 h，9 h，12 h and 24 h postinfection.RESULTS:The mRNA expression of Bax and Bim in control group was not significantly different among different time points，so was that in CVB3 infection group(all P＞0.05).However，compared with control group，the mRNA expression of Bax and Bim in CVB3 infection groups was decreased at 24 h postinfection(all P＜0.05).The protein expression of Bax and Bim in control group was not significantly different among different time points(P＞0.05).However，in CVB3 infection group，the protein expression of Bax was lower at 24 h postinfection than that at 3 h(P＜0.05).Meanwhile，compared with control group，the protein expression of Bax in CVB3 infection group was decreased at 24 h postinfection(P＜0.05).The protein expression of Bim in CVB3 infection groups was decreased along with the time postinfection，and was decreased at 9 h，12 h and 24 h as compared with control group(P＜0.05).CONCLUSION:The proteins of Bax and Bim play an important role in CVB3-induced apoptosis of HeLa cells.

HeLa cells;Coxsackievirus B3;Apoptosis;Bax protein;Bim protein

R725

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.024

1000-4718(2014)03-0524-05

2013-03-04

2014-01-07

国家自然科学基金资助项目(No.30973233);中南大学创新课题资助项目(No.2011ssxt196)

△通讯作者Tel:0731-88618205;E-mail:yang_zcr@126.com