一氧化氮/诱导型一氧化氮合酶在动脉粥样硬化过程中的作用*

边 宁， 龚博君， 郭 军， 黄正一， 李自成

(暨南大学附属第一医院心血管内科，广东广州 510630)

一氧化氮/诱导型一氧化氮合酶在动脉粥样硬化过程中的作用*

边 宁▲， 龚博君▲， 郭 军， 黄正一， 李自成△

(暨南大学附属第一医院心血管内科，广东广州 510630)

目的：探讨一氧化氮(NO)/诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)过程中的动态变化，分析其对动脉粥样硬化形成过程的影响。方法：将60只SD大鼠随机分成2组:对照组及AS组，每组30只。AS组采用维生素D3腹腔注射联合高脂饲料饲养的方法构建动脉粥样硬化模型。用相关生化方法检测血清各项生化指标:总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖和钙离子，比色法检测血清NO浓度，并对主动脉行HE染色，免疫组化技术检测iNOS蛋白表达，将所得数据进行统计分析，用简单线性相关分析NO与钙离子及动脉粥样硬化指数的相关性。结果：90 d后成功构建了主动脉中膜钙化型动脉粥样硬化模型。血清NO浓度在动脉粥样硬化过程中逐步下降，各组间差异均有统计学意义(均P＜0.05)。动脉粥样硬化过程中动脉粥样硬化指数与钙离子呈正相关，与NO呈负相关。在90 d的AS组粥样斑块区免疫组化技术检测到iNOS蛋白表达。结论：在动脉粥样硬化形成过程中，主动脉粥样斑块区iNOS蛋白高表达，但血清NO浓度逐渐降低，NO抗动脉粥样硬化作用减弱。

动脉粥样硬化;一氧化氮;一氧化氮合酶;钙

动脉粥样硬化是心脑血管疾病发生的核心病理基础。一氧化氮(nitric oxide，NO)既是一种气体信号分子，又是一种有效的血管舒张因子［1］，研究报道其舒张血管作用为一氧化碳的300～1 000倍。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是机体内 NO产生的关键酶，其同功酶有3种亚型［2］:诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)、神经元型NOS和内皮型NOS。为探究NO/iNOS在动脉粥样硬化过程中的作用，本研究拟采用维生素D3并高脂饲料构建动脉粥样硬化模型，通过检测血清中NO浓度的动态变化及iNOS在主动脉粥样斑块中的表达，以探讨NO/iNOS与动脉粥样硬化的关系。

材料和方法

1 方法

1.1 动物及造模 6～8周龄SPF级雄性SD大鼠60只，体重160～200 g，购自广东省医学实验动物中心。动物许可证号为SCXK(粤)2008-0002，粤监证字为2008A020。随机分成2组，对照组及动脉粥样硬化组(atheroslerosis，AS)组，每组30只。对照组普通饲料饲养，AS组高脂饲料饲养。高脂饲料配方为:胆固醇4%，胆酸钠0.5%，猪油10%，白糖5%，丙硫氧嘧啶0.2%，基础饲料80.3%。生产许可证号为SCXK(粤)2008-0002。AS组大鼠于实验开始前4 d给维生素D36×105U·kg-1·d-1腹腔注射，之后每30 d以3×105U·kg-1·d-1腹腔注射进行造模。

1.2 相关指标检测 实验开始当天、第45天及第90天将动物隔夜禁食，并于次日早晨8点10%水合氯醛麻醉后，用生化管腹主动脉采血，血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、钙离子(calcium ion，Ca2+)和空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)浓度分别采用TCH酶法、酶偶联比色法、沉淀分离法、酶联免疫法和葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测。动脉粥样硬化指数(atherosclerosis index，AI)计算公式为:(TC-HDLC)/HDL-C。低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)采用公式计算:LDL-C= TC-HDL-C。

1.3 血清NO浓度的检测 NO浓度检测试剂盒购自南京建成生物有限公司，检测过程严格遵循测试盒各项操作流程，采用比色法检测。试剂盒测试原理为:NO在含氧及水的环境中可生成硝酸盐及亚硝酸盐，通过采用硝酸盐显示剂能使硝酸盐及亚硝酸盐转化成偶氮化合物，再利用比色法间接测定血清中NO的浓度。

1.4 腹主动脉HE染色 对AS组90 d和对照组90 d主动脉行HE染色，在取主动脉样本前用4%甲醛行心脏灌洗，分离主动脉，将其浸泡于4%甲醛中，时间控制在24 h内，之后以浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，包埋，切片，并行HE染色。

1.5 免疫组化染色检测主动脉粥样斑块区iNOS的表达 兔抗大鼠 iNOS多克隆抗体购自 Abcam。PBS、柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)、即用型封闭血清、3%H2O2、DAB显色液和即用型免疫组织化学SP法染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用SP法进行免疫组织化学检测，操作步骤照试剂盒说明书进行。显微镜观察并拍照。

2 统计学处理

以SPSS 17.0统计软件分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。用简单线性相关分析动脉粥样硬化指数与NO和钙离子的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 血脂指标在各组间的比较

AS组90 d TC、TG和HDL-C水平与对照组90 d比较，差异有统计学意义(均P＜0.05)，AS组90 d TC及LDL-C水平与AS组0 d间的差异有统计学意义(均P＜0.05)，AS组90 d TC与AS组45 d比较，差异有统计学意义(均P＜0.05)，见表1。

表1 血脂指标的比较Table 1.Comparison of the blood lipid parameters(Mean±SD)

2 一般指标在各组间的比较

AS组0 d、45 d及90 d空腹血糖和钙离子水平在3组间的差异有统计学意义(均P＜0.05)。动脉粥样硬化指数在AS组90 d明显高于AS组45 d水平(P＜0.05)，见表2。

表2 动脉粥样硬化形成过程中一般指标的比较Table 2.Comparison of common parameters in the process of atherosclerosis(Mean±SD)

3 血清NO浓度在各组间的比较

血清NO浓度在整个动脉粥样硬化过程中呈现逐步下降的趋势，在AS组90 d与0 d及45 d间的比较，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，见表3。

表3 血清NO浓度在各组间的比较Table 3.Comparison of concentration of serum NO(Mean±SD)

4 相关性分析

对AS组动脉粥样硬化指数与血清NO间行相关分析显示，动脉粥样硬化指数和血清NO间有相关性(r=-0.756，P＜0.01);动脉粥样硬化指数和钙离子间同样具有相关性(r=0.738，P＜0.01)，见图1、2。

5HE染色

主动脉病理学HE染色结果，图3A示对照组90 d血管结构规整，中膜梭型平滑肌细胞清晰可见;图3B示AS组90 d血管结构不完整，中膜被钙化灶及斑块所占据，灶区及斑块区未见平滑肌细胞。

6 主动脉粥样斑块区域iNOS免疫组化染色

通过对照组90 d和AS组90 d腹主动脉行iNOS免疫组化染色对比发现，对照组为阴性(图4A)，AS组90 d在不规则粥样斑块区可见棕黄色阳性表达(图4B)，90 d时AS组iNOS蛋白表达显著高于对照组(P＜0.05)。

Figure 1.The correlation between atherosclerotic index and serum NO level in rats.图1 动脉粥样硬化指数与血清NO的相关性

Figure 2.The correlation between atherosclerotic index and serum calcium ion concentration in rats.图2 动脉粥样硬化指数与血清钙离子的相关性

Figure 3.The changes of atorta in control and AS group(HE staining，×100).A:control group at 90 d;B:atherosclerosis group at 90 d.图3 SD大鼠主动脉HE染色

Figure 4.The expression of iNOS protein in aorta detected by immunohistochemistry(×200).A:control group at 90 d;B:atherosclerosis group at 90 d.图4 SD大鼠主动脉iNOS蛋白的表达

讨论

NO作为上世纪以来一种研究较热门的气体信号分子。NO/iNOS与动脉粥样硬化［3］等其它心血管病关系密切。机体在正常情况下，NO主要在内皮型NOS关键酶的催化作用下由内皮细胞产生，当机体处于炎症反应等受损状态时，原本平滑肌细胞及巨噬细胞中处于低活性状态下的iNOS被激活。动脉粥样硬化过程中，一方面诱导型NOS催化下产生的NO通过与超氧阴离子结合生成过氧亚硝基阴离子［4］，另外机体不对称二甲基精氨酸浓度将增高，抑制内皮型 NOS表达［5］，在上述两方面的综合作用下，体内NO浓度、活性及生物利用度降低，通过促进三磷酸鸟苷生成环磷酸鸟苷，导致细胞内游离钙离子浓度增高，促进血管收缩，此外还可改变内皮细胞通透性，促使血管内皮功能紊乱，促进血管中膜损坏，加速动脉粥样硬化斑块形成。但具体机制尚未明确，有待进一步探究。既往研究报道原发性高血压、动脉粥样硬化及高脂血症患者较健康对照人群比较体内NO基础水平降低，可能与氧化应激关系密切［6］，但此结论尚未被公认。

本研究中，血清NO浓度在动脉粥样硬化动态形成过程中呈现逐步下降趋势，前45 d下降幅度低于后45 d，免疫组化结果显示AS组90 d时主动脉斑块区域iNOS蛋白高表达，在动脉粥样硬化过程中呈上升趋势。既往研究报道，高脂血症状态下，动脉内皮产生iNOS增多，使NO释放增多，该病理状态中常存在氧化应激反应，氧化应激体系中的超氧阴离子对机体所产生 NO以尚未明确的综合机制迅速降解［7-8］，这是导致动脉粥样硬化过程中iNOS表达增多但NO分泌减少的主要原因。本研究中NO呈现下降趋势，iNOS蛋白表达增多，考虑与既往研究报道所述氧化应激作用有关。此外动脉粥样硬化指数作为衡量动脉粥样硬化严重程度的重要指标，在本研究中动脉粥样硬化指数与NO呈负相关。以上结果说明了由于动脉粥样硬化过程中NO功能逐步减弱，抗动脉粥样硬化作用减弱，最终导致了动脉粥样硬化的形成。

钙离子作为机体重要的第二信使，其所参与的信号通路与动脉粥样硬化过程、细胞凋亡及线粒体功能紊乱等机制关系密切。钙离子内流增多导致细胞内钙超载，促进细胞凋亡。既往报道金属离子对动脉粥样硬化斑块的形成起促进作用［9-10］，动脉粥样硬化斑块中钙离子浓度显著高于正常组织［11］。动脉粥样硬化形成过程脂质条纹、纤维斑块及晚期复合斑块中组织钙含量分别为健康血管组织中的13倍、24倍及80倍。本研究中AS组45 d和90 d血清钙离子浓度显著高于同时段对照组水平，且相关分析中钙离子水平与动脉粥样硬化指数呈正相关，进一步在主动脉HE染色中，45 d和90 d血管中膜可见大量钙化灶及斑块出现。在上研究结果提示，钙稳态失衡与动脉粥样硬化关系密切。

本研究以钙超载和高脂血症为出发点，采用高脂饲料联合维生素D3的方法，成功构建了主动脉中膜钙化型动脉粥样硬化模型。通过对NO/iNOS在动脉粥样硬化过程中的具体变化进行实验探究，发现在动脉粥样硬化过程中斑块中iNOS蛋白高表达，血清NO分泌逐渐减少，抗动脉粥样硬化作用逐渐减弱，从而更有利于动脉粥样硬化斑块形成。以上研究结果可为临床试验和实验研究提供相关依据。

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Effects of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase on process of atherosclerosis

BIAN Ning，GONG Bo-jun，GUO Jun，HUANG Zheng-yi，LI Zi-cheng
(Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China.E-mail:zichengli @163.net)

AIM:To explore the dynamic changes of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase during the process of atherosclerosis，and to analyze their influence on the formation of atherosclerosis.METHODS:SD rats(n= 60)were randomly divided into control group and atherosclerosis group(30 rats in each group).Atherosclerosis model was induced by feeding high-fat diet and vitamin D3.The values of blood biochemical were analyzed enzymatically using bioMérieux kit.The concentration of serum nitric oxideing was detected by a colorimetric method.The success of atherosclerosis modeling was determined by pathological examination.The protein expression of inducible nitric oxide synthase in atherosclerotic plaque was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTS:The atherosclerosis model was successfully established in 90 d.The concentration of serum nitric oxide gradually decreased in atherosclerosis group，and a significant difference among groups was observed.Atherosclerosis index was positively correlated with calcium ion，and negatively correlated with nitric oxide.The protein expression of inducible nitric oxide synthase in the atherosclerotic plaque after 90 d was found.CONCLUSION:The protein expression of inducible nitric oxide synthase in the plaque area of aorta increases and the concentration of serum nitric oxide decreases with the process of atherosclerosis.The anti-atherosclerosis role of nitric oxide is gradually decreased.

Atherosclerosis;Nitric oxide;Nitric oxide synthase;Calcium

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.006

1000-4718(2014)03-0414-05

2013-12-27

2014-01-04

广东省科技计划项目(No.20101096136);广州市科技计划(No.2010Y1-C941);暨南大学第一临床医学院重点

学科基金(No.2010-4)

△通讯作者Tel:020-38688620;E-mail:zichengli@163.net

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