同位素标记敌百虫－甲氧基-D6和敌敌畏－甲氧基-D6的合成

杨维成，吕靖，齐庆瑞，盛立彦，李美华，杨超，罗勇

（1.上海化工研究院 技术开发中心 上海200062；2.新疆教育学院 职业教育分院，乌鲁木齐830046）

目前，国内针对动物源食品有机磷残留的检测方法中，敌百虫、敌敌畏的检测方法虽各自不同［4－7］，归纳起来通用的检测方法主要有：高效液相色谱法 （HPLC）［8－9］、气 相 色 谱 法 （GC）［15－13］、毛细管电泳法［14］、气相色谱－串联质谱法（GC／MS）［15－16］、液相色谱－串联质谱法（LC／MS）等方法［17－21］。其中，LC／MS法是近年发展起来的一种新技术，可在一级质谱（MS）条件下，获得较强的待测物准分子离子峰，并可借助MSn（n＝2～10），对准分子离子峰进行多级裂解，进而获得丰富的结构信息［22－23］。此方法可以有效克服敌百虫（GC／MS检测时）热分解造成的实验误差，前处理方法也对分析结果造成较大偏差。

同位素稀释质谱法（isotope dilution mass spectr o metr y，IDMS）是检测食品、饲料中残留的有效方法，采用与被测物质具有相同分子结构的稳定性同位素（15N，13C，2H等）标记的化合物作为内标物质，用LC／MS进行检测，可准确定量。发达国家对于食品、饲料中的残留均要求用质谱法检测，并规定判定标准，如欧盟的2002／657／EC指令。目前，国内80%以上的各类农残检测方法均使用同位素稀释质谱法，通过添加稳定同位素内标试剂，可有效消除样品在处理步骤中所引起的回收率差异，从而避免因为样品处理过程中的损失对检测结果造成的偏差，显著提高目标化合物的回收率和方法稳定性。稳定同位素内标的特性与LC／MS的高灵敏度和处理复杂样品的能力结合，使色谱／同位素稀释质谱技术成为测量微量及痕量有机物的基准方法，应用越来越广泛。

本研究结合敌百虫、敌敌畏工业合成路线［24－27］，在避免同位素丰度稀释的前提下，以CD3OD为标记起始原料，经与三氯化磷酯化得到亚磷酸二甲酯（I），再进一步与三氯乙醛加成得到敌百虫－甲氧基-D6（II）。敌百虫－甲氧基-D6继续碱解脱去一分子氯化氢，重排后生成敌敌畏-甲氧基-D6（III），可用于同位素内标试剂。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

CD3OD：上海化工研究院自制，丰度99.5%；敌百虫（纯度97.0%）、敌敌畏（纯度95.0%）：Dr.Ehrenstorfer Gmb H 生产，标准品；其余试剂均为市售分析纯或化学纯，未进一步处理。

高效液相色谱：日本Shi madzu公司；超高液相质谱联用仪：美国Themo Fisher Scientific公司；红外吸收光谱仪：美国Nicolet公司；核磁共振仪：瑞士Br uke公司。

1.2 敌敌畏－甲氧基-D6 的合成

1.2.1 亚磷酸二甲酯-D6（D7）的合成

2.树立现代治理理念。互联网精神与现代治理理念具有内在契合性，地方政府治理要坚定共享共治、开放透明、自由平等、民主法治的理念，超越威权思维，乘着 “互联网+”东风，向建设法治政府、透明政府、有限政府、服务型政府的目标扎实迈进。要以公众为中心、以治理效能为导向，促进公共产品和公共服务的 “互联网+”大发展。要充分接纳各治理主体的自主性并充分发挥其创造性，处理好政府、企业、社会之间关系，广泛整合治理资源，培育有机的治理生态。要以规则为准绳，不断规范政府治理行为，树立良好的政府形象。

将5.40 g（0.15 mol）CD3OD溶于18.5 mL的二氯甲烷中，6.86 g（0.05 mol）PCl3溶于10 mL二氯甲烷，在0～2℃下向CD3OD溶液中滴加PCl3溶液，滴加时间为0.5 h。滴加结束后，迅速升温至69℃，在该阶段溶液回流并有大量气泡产生，保温50 min后，待气体产生停止后终止反应。旋蒸后减压蒸馏，收集71～75℃（720 mm Hg）的馏分，称量后计算收率为84.5%，化学纯度在98%以上，氘同位素丰度为98.4%。LC-MS-ESI-：［M＋H］＋＝117、118。

1.2.2 同位素标记敌百虫－甲氧基-D6的合成

往圆底烧瓶中加入6.58 g（45 mmol）三氯乙醛，在70℃下滴加5.0 g（43 mmol）同位素标记的亚磷酸二甲酯，30 min后滴加结束。迅速升温至80℃并保温2 h至反应结束，将产品转移进行结晶，得到的固体称重为11.66 g，粗收率大于100%。产品进行5次重结晶后，总收率（以CD3OD计）为57.7%，化学纯度为98.5%，氘同位素丰度为98.4%。

1.2.3 同位素标记敌敌畏－甲氧基-D6的合成

取6.2 g（24 mmol）敌百虫－甲氧基-D6重结晶样品溶于44 g蒸馏水中，再加入20 mL苯，在5℃的水浴下滴加5%Na OH溶液30 mL，5 min之内滴加结束，升温至40℃，保温1 h，反应结束后分液、干燥、旋蒸，得到粗产品4.23 g，最后减压蒸馏得到产品3.2 g，计算总收率（以CD3OD计）为47.3%，经检测化学纯度为98.2%，氘同位素丰度为98.2%。

1.3 纯度分析

采用气相色谱分析亚磷酸二甲酯纯度。色谱柱：SPB-5柱；载气：N2，0.10 MPa；分流进样，进样温度：200℃；FID检测器，检测温度：220℃；氢气：0.15 MPa；空气：0.15 MPa；柱温：120℃～200℃。

采用岛津LC-20 AT高效液相色谱仪进行敌百虫、敌敌畏化学纯度分析，敌百虫分析：Kr o masil-C18柱（46 mm ×150 mm）；流动相：V（乙腈）∶V（水）＝1∶1；检测波长：205 n m；流速：1.0 mL／min。

敌敌畏分析：Kro masil C18柱（46 mm ×150 mm）；流动相：V（乙腈）∶V（水）＝1∶1；检测波长：211 n m；流速：1.0 mL／min。

1.4 结构鉴定

采用红外、核磁和液质联用进行结构确定。红外分析条件：KBr压片。核磁测试条件：400 Hz，CDCl3溶剂。质谱检测条件：电喷雾（ESI）离子源；采用正离子模式，喷雾电压3 500 V、鞘气12 bar、辅助气5 bar、毛细管温度275℃、Q1分辨率0.7 a mu。

2 结果与分析

2.1 同位素标记前体的制备

以甲醇和水为原料进行亚磷酸二甲酯的合成，其反应剧烈，历程复杂，反应条件对收率影响很大。为提高甲醇的利用率，选择四因素：温度（X1），时间（X2），投料比（X3），溶剂量（X4），采用均匀设计进行实验优化，均匀设计结果列于表1。利用DPS软件数据处理系统二次多项式逐步回归分析，得回归方程：

表1 亚磷酸二甲酯均匀设计结果Table 1 Unifor m design and experi mental results of di methyl phosphite

Y＝315.527 913 5－121.374 981 86 X3＋14.872 108 925 X3＊X3－0.000 487 692 744 6 X4＊X4－0.730 052 611 8 X2＊X3。

相关系数R＝0.099 41，F＝63.501 7，显著水平P＝0.003 1＜0.05，剩余标准差S＝1.336 4，调整后相关系数R＝0.986 3，Dur bin-Watson统计量d＝2.550 770 82。说明该方程能很好地拟合亚磷酸二甲酯的合成过程。

经过均匀设计得到较优的配实验工艺，其效果需要进行检验。本实验以计算所得最佳工艺条件：温度69℃，时间0.83 h，投料比3.0，溶剂量19 mL进行实验验证，实际收率为84.5%。基本与理论预测值吻合，说明此方程具有较好的指导意义。

2.2 敌百虫合成工艺选择

Javidan［26］等，采用微波加热方式，在 Al2O3催化剂作用下，合成得到敌百虫，取得较好的效果，参考此方法，并与常规加热方式进行对比，控制投料摩尔比n［（Me O）2PH］∶n（三氯乙醛）＝1∶1.05，实验结果列于表2。由表2可知，采用常规加热方式时，只需适当延长反应时间，其收率也可达到微波加热反应的水平，同时发现，当体系中不含催化剂Al2O3时，收率反而有所提高，此现象与文献［26］结果有别。最终选择不使用催化剂反应，初收率达到99%以上。高效液相色谱（HPLC）检测产品纯度为85%，需要进一步分离提纯。

表2 敌百虫合成实验结果Table 2Synthetic exploration of trichlorfon

2.3 敌百虫分离提纯

根据敌百虫在不同溶剂中的溶解度差别，选择复合溶剂进行重结晶。经过五次重结晶实验后，敌百虫提纯达到101.58%（标样纯度97.0%），经校正后，化学纯度为98.5%，可以作为内标应用。

2.4 碱量对敌敌畏合成的影响

通过敌百虫碱解的方法合成敌敌畏，碱量大小对敌敌畏收率影响显著，碱量太少会影响反应速率，而碱量太多则会促进敌敌畏进一步水解生成磷酸二甲酯和二氯乙醛。因此，本实验在文献［27］基础上，通过改变Na OH用量，考察其对合成敌敌畏的影响，实验结果列于表3，当Na OH与敌百虫的摩尔比为1.3∶1时，敌敌畏合成的收率达到81.1%。

表3 碱量对敌敌畏合成的影响Table 3Synthetic opti mization of dichlor ophos s

2.5 丰度实验

在优化条件下，按照丰度实验投料量，进行了多次验证实验，同时对所需实验装置进行彻底清洗，避免丰度稀释。使用CD3OD（氘丰度99.5%）为原料，按照实验获得的优化条件进行了同位素标记敌百虫－甲氧基-D6和敌敌畏－甲氧基-D6的合成。以消耗的CD3OD计算，同位素标记敌百虫－甲氧基-D6和敌敌畏－甲氧基-D6的收率分别为总收率为57.7%和47.3%，化学纯度均高于98.0%，氘同位素丰度均高于98.0%。

2.6 结构鉴定

合成得到的产品经MS、NMR、IR进行结构鉴定。敌百虫和敌敌畏多级碎片质量简图示于图1。

同位素标记敌百虫－甲氧基-D6，化学纯度为98.5%，氘 同 位 素 丰 度 为 98.4%。LC-MSESI-：［M ＋ H］＋＝ 263、265、267；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ4.52 （d，J＝ 11.9 Hz，1 H）；13C NMR （101 MHz，CDCl3）δ97.65、97.54（1C，C-Cl），δ80.66 -76.69（1C，C-OH），δ 54.28～53.12（2C，C-D）；FT-IR （KBr）ν／c m－1：3 354.9，2 898.6，2 585.0，2 269.8，2 206.6，2 156.4，2 081.1，1 876.2，1 819.3，1 373.9，1 250.8，1 203.7，1 047.9，1 019.4，917.0，835.7，812.5，782.0，710.4，619.5，522.8，468.0，438.0。

同位素标记敌敌畏－甲氧基-D6，化学纯度为98.2%，氘 同 位 素 丰 度 为 98.2%。LC-MSESI-：［M＋H］＋＝227、229、231，1H NMR （400 MHz，CDCl3），δ7.00 （d，J＝ 5.3 Hz，1 H）；13C NMR （101 MHz，CDCl3），δ133.65～133.61（1C，C-H），δ113.99～113.85（1C，C-Cl），δ 54.83～53.92（2C，C-D）；FT-IR （KBr）ν／c m－1：3 076.0，2 264.1，2 080.8，1 645.0，1 282.5，1 151.3，1 112.7，1 049.1，972.0，919.0，837.0，806.1，734.8，655.7。

以上数据与目标化合物结构式相符，表明所合成的化合物即为目标化合物。

图1 敌百虫、敌敌畏多级碎片质量简图Fig.1 Multistage fragment mass diagram of trichlorf on and dichlorophos

3 讨论

在同位素有机合成中，由于同位素原料价格昂贵，因此衡量其合成路线优劣的主要因素是同位素原子的利用率、产物的化学纯度和同位素丰度，尤其是氘化合物的同位素丰度，易与外界中氢发生交换，造成丰度稀释。在合成中，一般选择待标记分子的骨架或者其稳定基团，以避免同位素丰度的稀释。实验中，以甲基作为氘原子的引入基团，采用CD3OD作为基础试剂，选择合适的反应条件，合成敌百虫－甲氧基-D6和敌敌畏－甲氧基-D6，并对合成过程中多个关键步骤进行了优化，提高了最终产物的纯度和收率。

中间体稳定同位素标记亚磷酸二甲酯的分子离子峰为m／z＝117、118，说明在合成过程中，甲氧基上6个H被D取代，而合成得到的部分亚磷酸二甲酯分子中P-OD中的D也被环境中H取代，即合成产品中包含亚磷酸二甲酯－［D6］和亚磷酸二甲酯-［D7］，其比例约为1∶3.9。

目标产物同位素标记敌百虫－甲氧基-D6和敌敌畏－甲氧基-D6的分子离子峰与相应的分子式的相对分子质量一致，其同位素丰度经计算分别为98.4%、98.2%，通过目标产物的二级质谱图，确认了敌百虫、敌敌畏裂解规律（见图1），为目标化合物在食品安全检测中做内标应用奠定了基础。

在1H NMR谱图中，－OCH3的特征吸收峰明显消失，说明目标产物中2个－OCH3中的6个H原子被D原子取代。在同位素标记的敌百虫1H NMR谱图中，－OH也同时消失，说明－OH上的H原子也同样被D原子取代，但在MS谱图中，显示只有－OCH3的H被取代，其原因可能是－OD的D原子较活泼，在进行质谱测试时，直接发生交换，变为普通H原子。在IR谱图中，目标产物分子式的各官能团的吸收峰都比较明显。

4 小结

（1）以同位素标记物CD3OD为标记前体，利用有机合成方法，通过甲基化、碱解等步骤，以良好收率合成出稳定同位素标记敌百虫－甲氧基-D6和敌敌畏－甲氧基-D6，并有效避免了氘同位素丰度的稀释。

（2）优化合成工艺条件。氘同位素标记敌百虫－甲氧基-D6总收率为57.7%，氘同位素标记敌敌畏－甲氧基-D6总收率为47.3%。

（3）产品经高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）检测，化学纯度大于98.0%，氘同位素丰度高于98.0%，未出现同位素明显稀释现象，可作为同位素内标应用于食品安全检测。

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