忍冬木层孔菌总酚的HPLC分离及其指示性成分分析

周 俊 孙文军 张 玲 汪鋆植 罗友成 吴晓娟 闫喜明

（1.三峡食品药品检验检测中心，湖北 宜昌 443005；2.三峡大学 生物与制药学院，湖北 宜昌 443002）

忍冬木层孔菌（phellinus lonicerinus（Bond.） Bond.et sing）是药用真菌桑黄的品种之一，收载于《湖北中药材质量标准》（2009年版）［1-3］，为湖北省药用桑黄主流品种，是土家族常用药物.桑黄是目前国际公认的抗癌效果最好的药用菌之一，具有“森林黄金”之美称，近年来，日本、韩国、中国相继对其进行开发利用，应用前景广阔［4］.研究表明忍冬木层孔菌含有多种酚性成分，具有抗癌、抗炎等活性，在食品、药品等领域内具有很高利用价值.故本试验对忍冬木层孔菌总酚进行了分析及制备，为忍冬木层孔菌的进一步研究与利用提供了依据.

1 仪器与材料

KQ－500DB型超声波清洗仪，艾朗旋转蒸发仪（德国），ME215S型十万分之一电子天平（德国Sartorios公司），25kg电子天平，紫外分光光度计（UV－2201，日本岛津公司），高效液相色谱仪（DIONEX Ultimate 3000，美国戴安液相色谱有限公司），核磁共振仪（UltrashiedTM 400MHZ Plus，bruker布鲁克公司），冷冻干燥机（FREEZ0NE PLUS 6，LABCONCO）.

忍冬木层孔菌子实体采自湖北省神龙架林区，经中国科学院微生物研究所卯晓兰教授鉴定为phellinus lonicerinus（Bond.）Bond.et sing，标本存放于天然产物研究与利用湖北省重点实验室（三峡大学）；95%乙醇，工业级；AB－8大孔树脂.

2 实验方法与结果

2.1 忍冬木层孔菌总酚提取

将干燥的忍冬木层孔菌子实体粉碎，取2kg忍冬木层孔菌菌粉经10L95%乙醇超声辅助提取［5］，每次3h，提取3次，合并提取液，经45℃减压浓缩获得忍冬木层孔菌醇提物浸膏.用少量水悬浮浸膏，上大孔吸附树脂富集多酚，乙醇梯度洗脱（0、20%、40%、60%、70%、80%、95%）.洗脱液用三氯化铁显色剂定性鉴定多酚，将含有多酚的流分合并，经旋转蒸发仪45℃浓缩，干燥，称重，计算得率.即得忍冬木层孔菌总酚.2kg忍冬木层孔菌制得总酚约8g，提取率约为4‰.

2.2 忍冬木层孔菌总酚中指示性成分分离

2.2.1 忍冬木层孔菌总酚分析

采用分析型高效液相色谱法（HPLC）分析忍冬木层孔菌总酚，取适量总酚样品，用甲醇溶解，0.22 μm滤膜过滤作为待测样品.分析条件为：流动相乙腈10%～100%，超纯水90%～0%，变梯度洗脱，洗脱时间为30min，检测器波长采用254nm，色谱柱：迪马科技钻石二代C18色谱柱Diamonsil C18（250mm×4.6mm.id.，5μm），柱温25℃.高效液相色谱图如图1所示.

图1 忍冬木层孔菌总酚HPLC分析图

分析表明，忍冬木层孔菌总酚含有较多的中等极性化合物，其中有几个含量较大的成分，已达到基线分离，可以采用高效液相色谱进行制备.

2.2.2 忍冬木层孔菌总酚中指示性成分制备

称取0.5g总酚样品，用适量甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤作为制备样品.用半制备高效液相色谱进行制备，制备液相条件为：流动相，乙腈30%～60%，超纯水70%～40%，洗脱时间35min，检测器波长采用254nm，制备柱：Agela Technologies，10×250nm，10 μm，柱温25℃.收集主要峰洗脱液，40℃经旋转蒸发仪浓缩至少量（1～2mL）液体，移至干净的安剖瓶，冷冻干燥，得黄色不定型粉末.

取少量经分析高效液相色谱法检验其纯度.液相条件：流动相，乙腈10%～100%，超纯水90%～0%，变梯度洗脱，洗脱时间为30min，检测器波长采用254nm，色谱柱：Agela Technologies，10×250nm，10μm，柱温25℃.其色谱图如图2～3所示.

图2 化合物1HPLC分析图

图3 化合物2HPLC分析图

经峰面积归一化法判断，这两个化合物的纯度达到做核磁共振色谱的要求.经核磁共振进行结构鉴定.化合物1鉴定为原儿茶酸，化合物2鉴定为3，4－二羟基苄叉丙酮.核磁图谱的数据如下：

化合物1，分子式：C7H6O4.无色针晶（甲醇），m.p.200～202℃.ESI－MS m／z：155 ［M＋H］＋.1HNMR（400MHz，methanol－d4）δH：7.44（1H，dd，J＝2.0，8.5Hz，H－6），7.41（1H，d，J＝2.0Hz，H－2），6.74（1H，d，J＝8.5Hz，H－5）.13C－NMR（100 MHz，methanol－d4）δC：170.3（COOH），151.6（C－3），146.1（C－4），123.9（C－1），123.1（C－6），117.5（C－2），115.7（C－5）.与文献报道的原儿茶酸（protocatechuic acid）核磁数据相一致［6］.

化合物2，分子式：C10H10O3.淡黄色针状结晶，溶于丙酮.1H－NMR（400MHz，CDCl3）δ：6.47（1H，d，J＝16.4Hz，8－H），7.45（1H，d，J＝16.4Hz，7－H），7.00（1H，J＝8.0，2.0Hz，6－H），6.77（1H，d，J＝8.0Hz，5－H），7.05（1H，d，J＝2.0Hz，2－H）；13CNMR（100MHz，CDCl3）δ：125.8（C－1），114.8（C－2），145.6（C－3），148.5（C－4），115.8（C－5），121.5（C－6），144.0（C－7），123.9（C－8），197.7（C＝O），27.1（CH3）.与文献报道的3，4－二羟基苄叉丙酮一致［2］.

2.3 忍冬木层孔菌总酚含量测定

2.3.1 忍冬木层孔菌总酚中原儿茶酸及3，4－二羟基苄叉丙酮的含量测定

用高效液相测定忍冬木层孔菌总酚中原儿茶酸及3，4－二羟基苄叉丙酮的含量.精确称取原儿茶酸及3，4－二羟基苄叉丙酮，用色谱级甲醇配成1mg／mL溶液，0.22μm滤膜过滤作为标准品.精确称取5mg忍冬木层孔菌总酚，用色谱级甲醇配成1mg／mL，0.22μm滤膜过滤，作为待测样品溶液.平行做3份样.

绘制标准曲线，分析条件：色谱柱Diamonsil C18（250mm×4.6mm.id.，5μm），柱温25℃，流动相乙腈17%，超纯水83%，检测原儿茶酸时波长设定为256nm，检测3，4－二羟基苄叉丙酮时波长设定为328nm，分别进样不同浓度的标准液，计算各自的标准曲线：原儿茶酸标准曲线y＝636.74x＋34.850，r＝0.9995，3，4－二羟基苄叉丙酮 标准曲线 y＝830.85x-693.45，r＝0.9996.标准曲线线性度较好.

进样10μL忍冬木层孔菌总酚待测液，重复5次，计算RSD，检测方法的重复性，RSD＝2.19%，方法重复性良好.5份平行各进样10μL，计算RSD，检测方法的重复性，RSD＝3.29%，方法重复性良好.另外取其中一平行样，每隔0，2，4，6，8，10，24h，检测方法的精确性，RSD＝2.91%，该方法24h内稳定性较好.

经计算，忍冬木层孔菌总酚中，原儿茶酸的含量为13.1%，3，4－二羟基苄叉丙酮的含量为12.2%.

2.3.2 忍冬木层孔菌总酚含量测定

用原儿茶酸作为对照品，采用普鲁士蓝紫外-可见分光光度法检测忍冬木层孔菌总酚中酚的含量.

标准曲线的绘制：吸取1mg／mL的原儿茶酸溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8mL 加入10mL容量瓶中，对应加入1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.2mL甲醇，再分别加入0.008mol／L 铁氰化钾溶液、0.1mol／L盐酸、0.1mol／L三氯化铁各0.2 mL，用纯水定容至刻度，摇匀静止15min.用比色皿在紫外可见分光光度计上先进行紫外扫描，发现最大吸收波长为730nm，与文献报道一致.在730nm处比色，绘制标准曲线.

显色稳定性：吸取0.5mL待测液加入10mL容量瓶，同绘制标准曲线的方法处理，每隔20min，测一次730nm的吸光度，以检测显色的稳定性.

吸取0.5mL的忍冬木层孔菌总酚待测液加入10mL容量瓶，同绘制标准曲线的方法测总酚在730 nm处的吸光度.平行做3份，结果如图4所示.

图4 原儿茶酸几种浓度下的吸光度

由图6可知，原儿茶酸的加样量在0.1～0.5mg时，吸光度与加样量有线性关系，标准曲线绘图如下，标准曲线为：y＝1.015x＋0.4475，线性相关系数r＝0.9993.

显色稳定性：在2h内，总酚在730nm处的吸光度RSD为2.59%，2h后，容量瓶中蓝色液体开始出现絮状物.普鲁士蓝是一种蓝色染料，水中溶解性很差.故该方法在2h内，显色有效.

忍冬木层孔菌总酚的测定结果：根据标准曲线y＝1.015x＋0.4475，计算出吸光度y对应下的酚x，除以0.5mg，即得忍冬木层孔菌总酚中的酚含量.

表1 忍冬木层孔菌总酚的酚含量

测定结果显示供试品中的忍冬木层孔菌总酚的酚含量为63.35%.

3 讨 论

酚性成分广泛分布于中药中，是多种中药的有效成分，具有多种药理活性，如抗炎、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗凝血、清除自由基及保护神经细胞等.前期研究表明，忍冬木层孔菌中含有多种酚性成分，与其抗炎、抗肿瘤活性密切相关，因此，对忍冬木层孔菌总酚进行了制备和分析.从总酚中得到两种主要成分：原儿茶酸，3，4－二羟基苄叉丙酮.

采用乙醇超声辅助提取，大孔树脂吸附，乙醇洗脱制备忍冬木层孔菌总酚，得到总酚的含量达到63.35%，符合有效部位质量要求，为进一步研究总酚提供了基础.但该工艺制备总酚，得率较低，总酚的提取工艺需要进一步优化.

总酚中原儿茶酸的含量为13.1%，3，4－二羟基苄叉丙酮的含量为12.2%.两种成分均具有抗肿瘤等药理活性.可作为总酚的指示性成分.由于原儿茶酸易于获得，故采用原儿茶酸为对照品测定总酚含量.原儿茶酸最大吸收波长为256nm，3，4－二羟基苄叉丙酮最大吸收波长为328nm.为了准确测定含量，选用双波长同时测定两种成分含量.

忍冬木层孔菌是桑黄的品种之一，具有良好的抗肿瘤作用，原儿茶酸，3，4－二羟基苄叉丙酮等酚性成分可能是忍冬木层孔菌发挥抗肿瘤作用的主要有效成分.但原儿茶酸、3，4－二羟基苄叉丙酮是否是忍冬木层孔菌抗肿瘤作用的主要有效成分及其相互作用有待进一步深入研究.

［1］湖北省药品食品监督管理局编.湖北省中药材质量标准［M］.武汉：湖北科学技术出版社，2009：113－114.

［2］王晓梅，罗友成，郭志勇，等.忍冬木层孔菌化学成分研究［J］.中药材，2011，34（6）：891－893.

［3］刘春静，戴玉成.中国锈革孔菌科一新记录种—忍冬木层孔菌［J］.林业科学研究，2002，15（4）：413－415.

［4］吕英华，王建芳，李玉平，等.药用真菌桑黄的研究进展［J］.蚕业科学，2009，35（1）：204－210.

［5］王贤萍，段泽敏，孟晶岩，等.超声波提取苹果多酚类物质的优化研究［J］.山西农业科学，2007，35（5）：34－38.

［6］方 炜，万金志，张丽艳，等.高速逆流色谱法同时分离制备头花蓼中没食子酸和原儿茶酸［J］.天然产物研究与开发，2011，23：299－303.