复方刺梨合剂高效液相色谱指纹图谱研究

蒋正立,戴丹平,林忠

(浙江省台州医院药剂科,临海 317000)

复方刺梨合剂高效液相色谱指纹图谱研究

蒋正立,戴丹平,林忠

(浙江省台州医院药剂科,临海 317000)

目的 建立复方刺梨合剂的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱研究方法。方法采用HypersilC18(4.6 mm× 250 mm,5 μm)色谱柱,流动相为6%甲醇(pH3.05)-甲醇进行梯度洗脱,检测波长270 nm,流速1.0 mL·min-1,柱温30℃,检测10批复方刺梨合剂,建立指纹图谱。结果以维生素C为参照物峰,指纹图谱标记了14个共有峰,10批相似度以平均数和中位数计算均>0.99。结论该方法具有良好的精密度、重复性、稳定性,可用于复方刺梨合剂质量的综合评价。

刺梨合剂,复方;色谱法,高效液相;指纹图谱

复方刺梨合剂是浙江省台州医院医院制剂,为刺梨和苍术的复方制剂,具有健脾燥湿、消食和胃等功效,临床用于治疗食积不化、胃脘胀满、泄泻等[1]。《浙江省医疗机构制剂规范》(2005年版)虽有收载复方刺梨合剂质量标准(含性状、鉴别和检查项目),但其质量标准较低。查阅复方刺梨合剂质量控制的相关文献[2-9],其质量标准仅对合剂中某一成分的含量进行控制[4],不能全方位表征其内在质量,故很难确保复方刺梨合剂的质量。为更好地控制制剂质量,为其物质基础研究提供参考,笔者对复方刺梨合剂进行高效液相色谱(HPLC)指纹图谱研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪(Waters717进样器,1525泵与2487检测器,Breeze数据处理系统),TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂),PHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司),SB25-12D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试剂与药品 维生素C对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100425-200702,含量:100.0%),刺梨对照药材(浙江省食品药品检验研究院,批号: 20070820,经浙江省台州医院王美萍副主任中药师鉴定为Rosa roxbughiiTratt.的果实),苍术对照药材(中国食品药品检定研究院,批号:120932-200405,经浙江省台州医院王美萍副主任中药师鉴定为茅苍术A.lancea(Thunb.)DC.的干燥根茎),复方刺梨合剂(浙江省台州医院制剂室自制,批准文号:浙药制字Z20100038,批号:130107,121105,121011,120913, 120801,120702,120628,120504,120419,120314, 120209,规格:每瓶250 mL);甲醇为色谱纯,水为重蒸纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil C18(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流动相:6%甲醇(pH3.05)A-甲醇B,进行梯度洗脱(A:0～16 min,100%;16～46 min, 100%→59.4%;46～51 min,59.4%;51～56 min, 59.4%→38.7%;56～84 min,38.7%→17%)检测波长:270 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱温:30℃;进样量:20 μL。

2.2 参照峰的选择 维生素C为复方刺梨合剂中有效成分,维生素C的HPLC测定技术比较成熟,在色谱图中峰面积较大,出峰时间适中且稳定,故选维生素C作为本研究的参照峰。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取维生素C对照品适量精密称定,加水,制成每毫升含维生素C1.0 mg的对照品溶液。当日配制,2～8℃保存,临用时用流动相稀释成不同浓度的标准系列。

2.3.2 对照药材溶液的制备

2.3.2.1 刺梨原汁的制备 取刺梨对照药材1.0 g,加水50 mL,加热至沸并保持微沸30 min,放冷,滤过并冷却至0℃,经离心(9 000 r·min-1,离心15 min,离心半径6.0 cm,)后超滤,滤液低温真空浓缩,即可。

2.3.2.2 苍术原汁制备 取苍术对照药材1.0 g,加药材3倍量水煎煮1 h,取煎液后加药材2倍量水再煎煮1 h,合并两次煎液,滤过,滤液静置24 h,取上清液浓缩至相对密度1.15～1.20(60℃),即可。

2.3.3 供试品溶液的制备 将样品摇匀,离心(9 000 r·min-1,离心15 min,离心半径6.0 cm),取其上清液1 mL,置50 mL量瓶中,加水稀释并定容摇匀,即可。

2.4 方法学验证

2.4.1 精密度实验 取同一批号(批号:120702)制剂的供试品溶液,连续进样6次进行测定,考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性,结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.13%～0.17%,相对峰面积的RSD为1.92%～2.90%,表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性实验 取同一批(批号:120702)制剂的供试品溶液,分别在0,1.5,3,6,9,12,18,24 h进样,测定,考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性,结果显示各共有峰相对保留时间的RSD为0.11%～0.89%,相对峰面积的RSD为1.36%～2.83%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性实验 取同一批(批号:120702)样品,按照供试品溶液的制备方法制备5份,依次进行测定,考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性,结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.08%～ 2.48%,相对峰面积的RSD为1.23%～2.95%,RSD＜3.00%,表明本方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

2.5.1 指纹图谱的建立 取10批复方刺梨合剂样品,分别按“2.3.3”项供试品溶液制备方法进行处理,再按“2.1”项条件进行HPLC指纹图谱测定,根据10批供试品溶液HPLC提供的相关参数,以维生素C为参照峰,其相对保留时间约为1.000 0,标记了复方刺梨合剂指纹图谱中14个共有(特征)峰,其相对保留时间和相对峰面积见表1,2。

经分析表1、表2数据,发现10批样品的HPLC指纹图谱中各批号样品间共有指纹峰的相对保留时间比较吻合,但部分批号个别峰相对峰面积波动较大,认为可能是生产所用原料各批次间存在差异,如原料产地、采收、加工等不同导致了原料中各组分的含量存在差异所致。

2.5.2 指纹图谱相似度评价 将10批样品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版),设定匹配模板,进行谱峰自动匹配,生成对照指纹图谱(图1),进行相似度评价。样品与对照图谱的相似度以平均数计算分别为0.997,0.991,0.994, 0.991,0.998,0.994,0.999,0.999,1.000,1.000,以中位数计算分别为0.997,0.991,0.994,0.991,0.998, 0.999,0.999,1.000,1.000,1.000,均>0.99。10批不同批次复方刺梨合剂样品指纹图谱相似度均>0.99,图谱确定共有峰14个,各峰分离良好。实验表明,此法简便、重复性好,所建指纹图谱相似度较好,故笔者认为本色谱条件下建立的刺梨合剂HPLC指纹图谱,能较好满足复方刺梨合剂的质量控制。

2.5.3 拆方分析 按照“2.1”项色谱条件,分别测定刺梨对照药材、苍术对照药材、维生素C的HPLC图(图2),并与复方刺梨合剂的指纹图谱色谱峰一一对照,结果发现复方刺梨合剂样品中4号峰的保留时间与苍术对照药材中1号峰相吻合,1～3和5～14号峰与刺梨对照药材中1～13号峰相吻合,且1号峰的保留时间与维生素C吻合。其中1号峰不能完全和其他组分分离,但由于1号峰旁的其他组分的含量远小于1号峰所代表的维生素C的含量,其峰高比>10倍,可将其他组分的峰当基线处理,完全符合理论。11号峰由3个峰构成,由于这3个峰不能完全独立开来,所以就将它视作一个峰。其他的12个共有峰都能完全的独立分开。

表1 10批样品指纹图谱共有峰的相对保留时间

表2 10批样品指纹图谱共有峰的相对保留峰面积

图1 复方刺梨合剂的HPLC指纹图谱

3 讨论

图2 刺梨对照药材、苍术对照药材、复方刺梨合剂HPLC指纹图谱

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3.1 流动相的选择 复方刺梨合剂中含有多种化学成分[6],很难找到较理想的等度洗脱条件。本实验根据文献[2-9]和实验条件分别采用了乙腈-水、甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾、甲醇-水等不同浓度、不同比例的等度和梯度洗脱条件进行了实验,结果都不理想,虽然维生素C在0.05 mol·L-1磷酸二氢钾-甲醇(96∶4)条件下能从混合物中分离出来,但是由于盐浓度太高,容易在梯度洗脱过程中使色谱柱堵塞,所以也不理想。最后发现用磷酸调6%甲醇pH到3.05能使维生素C理想分离出。分析时采用梯度洗脱,A相为6%甲醇(pH3.05),B相为甲醇,经比较洗脱条件,最后确定程序为A:0～16 min,100%;16～46 min,100%→59.4%;46～51 min,59.4%;51～56 min,59.4%→38.7%;56～84 min,38.7%→17%,得到满意结果。

3.2 检测波长的选择 参考相关文献报道[2-9]在258, 270,300,320 nm波长处对复方刺梨合剂中主要成分进行考察,结果显示:①刺梨原汁在λ=258 nm下各组分吸收峰呈现较完全,而苍术原汁在λ=258 nm下几乎无吸收;②在λ=300 nm,320 nm下刺梨原汁吸收不完全;③在λ=270 nm下刺梨原汁虽吸收峰的分离度没有在λ=258 nm处好,但是苍术原汁在λ=270 nm下有一成分出峰,且分离度好。且复方刺梨合剂中的主要有效组分是刺梨,所以综合上述情况,实验选择λ= 270 nm为检测波长。

3.3 柱温的选择 对柱温在25,30,35℃进行考察,结果显示柱温在30℃时,色谱分离时间短,分离效果好。

3.4 样品处理方法的选择 本实验分别用孔径为4.5 μm微孔滤膜、9 000 r·min-1(离心半径Rmin= 3.7 cm,Rmax=6.0 cm)离心15 min分离同一批样品得溶液,并将所得溶液稀释50倍,在“2.1”项条件下进样,测得HPLC图,结果将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)得各成分的峰面积RSD＜0.2%,且离心法操作简单,所以本实验采用离心法处理样品。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.031

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蒋正立(1980-),男,浙江临海人,主管药师,学士,研究方向:医院药学。电话:0576-85199355,E-mail:jiangzl @tzhospital.com。