不同种植方式下烤烟根系差异表达蛋白质分析

尤垂淮，陈冬梅，黄锦文，唐莉娜，徐志兵，张重义，林文雄*



不同种植方式下烤烟根系差异表达蛋白质分析

尤垂淮1,2，陈冬梅1,2，黄锦文1，唐莉娜3，徐志兵1,2，张重义1,2，林文雄1,2*

（1.福建农林大学农业生态研究所，福州 350002；2.福建农林大学烟草研究所，福州 350002；3.福建省烟草专卖局烟草农业科学研究所，福州 350003）

通过根系差异蛋白质组学探讨了种植方式（复种连作、复种轮作）对烤烟生长的影响。结果表明，共有15个蛋白质表达丰度发生变化，用LC-MS/MS鉴定了14个差异蛋白质点，经生物信息学分析，11个蛋白质的功能有注释，其中3个属于与香气形成有关的蛋白质，包括转酮醇酶、单脱氢抗坏血还原酶和O-甲基转移酶，它们在复种轮作条件下均上调表达，此可能有助于烟叶品质提高，而复种连作处理下调表达，可能不利于品质提高。还鉴定到涉及能量、抗性、物质运输、核酸等功能的蛋白：磷酸甘油酸酯激酶、线粒体内膜移位酶亚基Tim13、NBS-LRR、DnaJ、细胞内囊泡运输蛋白Sly1、核糖体蛋白质，在复种轮作下也上调表达，此可能促进烤烟的生长，有利于提高烟草产量和品质且经济效益较好。而在复种连作处理下调表达，进而可能使得烟草生长变弱、产量降低、品质变差。

烤烟；双向电泳；蛋白质组学

烟草属忌连作作物，生产上因单种连作或复种连作都存在连作障碍。李天福等[1]研究表明，种植烟草的间隔时间越短，发病率越高，而且烟草花叶病、烟草黑胫病、根黑腐病、根结线虫病、青枯病、赤星病、炭疽病、角斑病和低头黑等的发病率都与连作年限呈不同程度的正相关。由于烟草各种病害发生，造成产量和品质明显下降[2]，造成巨大的经济损失。据初步估计，每年全国烟叶10%~15%的损失由各种病害造成的，严重时高达70%~90%，甚至绝收[3]。当前，我国因烟草连作，每年直接及间接经济损失高达40亿元[4]，烟草可持续发展已经受到严重威胁，严重影响烟草的生产和区域经济的发展。有关烟草连作障碍的研究还处于初步阶段，分子机理方面尚未报道，需深入研究。

随着拟南芥（）、水稻（）和杨树（）等植物全基因组序列测定的完成和基因组学研究的深入，植物蛋白质组学研究已经成为后基因组时代的热点之一[5]。近年来，差异蛋白质组学应用于植物或作物科学相关的分子机制研究日益增多，从分子水平较好地解释了植物/作物自身遗传表达或对环境响应的分子机理。如在植物生理蛋白质组学、植物突变体蛋白质组学、植物遗传多样性蛋白质组学和植物发育蛋白质组学等方面的研究[6-8]。

运用差异蛋白质组学技术来研究烤烟根系蛋白质，在国内外还很少报道。根系作为连接烟草地上部和土壤的“中间桥梁”，同时分泌各种次生代谢物，在烟草品质的形成扮演着非常重要的角色。本研究对复种连作和复种轮作下烤烟根系蛋白质进行提取，进行差异蛋白质组学分析，旨在分子水平上研究烤烟连作障碍的机理，为减轻甚至解决烤烟连作障碍提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2007—2010年在南平浦城县仙阳烤烟试验站基地进行，试验田地势平坦，土壤质地为砂壤，土壤pH 5.0，有机质34.8 g/kg，速效氮180.0 mg/kg，速效磷21.6 mg/kg，速效钾103.0 mg/kg，全氮2.38 g/kg，全磷0.73 g/kg，全钾34.5 g/kg，阳离子交换量7.8 cmol/kg。试验采取2种种植方式（表1），即（1）复种连作模式：早季种烟，烟收获后种水稻（烤烟-水稻→烤烟-水稻→烤烟）；（2）复种轮作模式：第1年，早季种烟，烟收获后种水稻，第2年，早季种水稻，晚季也种水稻（烤烟-水稻→水稻-水稻→烤烟）。试验采用随机区组设计，3次重复，共6个小区。每个小区种5畦，每畦植烟44株，共220株，行株距1.2 m×0.5 m。田间管理都按规范化栽培措施进行，从2008年开始实行田间定位试验，在田间定位第3年即2010年，取样进行相应实验。供试烤烟品种为K326。

表1 种植方式

1.2 取样

2010年烤烟旺长后期时取根系，用水洗净后甩干，用剪刀剪相同部位根系，每个处理3个重复，有代表性9株烟，每3株根系混匀，作为1个重复，用锡箔纸包住，迅速置于液氮中，之后一并保存到-80 ℃冰箱备用。

1.3 试剂与仪器

丙烯酰胺、N，N-甲叉丙烯酰胺、载体两性电解质Ampholine（pH 3-10, pH 5-8）、3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）等产品购自国外；聚乙烯吡咯烷酮、三氯乙酸、甘油、磷酸、甲醛等试剂为国药集团化学试剂公司产品，均为分析纯。所有溶液均用Milli-Q超纯水配制。

高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品；真空干燥机出自上海新苗医疗器械制造有限公司；Protean IEF等电聚焦系统、SDS-PAGE垂直电泳均产自美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统imagescan为瑞典GE Healthcare公司产品；紫外-可见分光光度计为美国VARIAN公司产品；LC-MS/MS液相质谱为美国Thermo公司产品。

1.4 根系蛋白质样品的制备

称取5 g根系，加入少许聚乙烯吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨至粉末，采用Mg-NP40法：参照Lee等[9]的方法并有所改进，加入10 mL提取缓冲液（0.5 mol/LTris缓冲液pH 8.3, 2%V/V NP-40，20 mmol/L MgCl2，2%V/V B-巯基乙醇，1 mmol/L苯甲基磺酰氟），置冰上摇床振荡5~10 min，置冰上超声30 min。4 ℃，10000 rpm，离心30 min，取上清。加入3倍体积10%三氯乙酸（10%三氯乙酸，0.07%B-巯基乙醇，丙酮），置于-20 ℃冰箱过夜。多洗几次，期间用80%丙酮（含0.07% B-巯基乙醇）洗1次，直至上清液澄清。最后4 ℃，11 000 rpm，离心25 min，弃上清，低温真空干燥，制成蛋白质干粉，置于-80 ℃冰箱备用。

1.5 蛋白质的裂解与浓度测定

1.5.1 蛋白质的裂解 Mg-NP40法提取的根系蛋白质干粉与裂解液的比例为1 mg :10 μL。裂解液的配方为：42%尿素 2M Thiourea，65mM DTT，4% CHAPS，0.2%两性电解质（pH 3.5~10）。

1.5.2 蛋白质浓度的测定 根据Bradford[10]方法，用牛血清白蛋白制作标准曲线，蛋白浓度为0~90 μg/μL，在λ=595 nm时，应用紫外-可见分光光度计测定蛋白质浓度。

1.6 双向电泳

1.6.1 第一向等电聚焦电泳 参照王经源等[11]的方法，进行自制一向管胶的制备，在25 ℃，按以下程序，200 v 0.5 h，300 v 0.5 h，400 v 0.5 h，500 v 0.5 h，600 v 0.5 h，800 v 16.5 h，1000 v 4 h，1200 v 2 h，进行一向等电聚焦。

1.6.2 胶条平衡 等电聚焦结束后，取出胶条，加入5 mL平衡液（Tris-HCL（pH6.8）4 mL，SDS 2 g，β-巯基乙醇 5 mL，甘油10 mL，稍加溴酚蓝，蓝色即可），平衡15~30 min。

1.6.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 参照王经源等[11]的方法制备二向胶，电泳程序[12]，设置3个阶段：（1）300 v，15 mA，0.5 h；（2）300 v，20 mA，2 h；（3）300 v，25 mA至溴酚蓝带达到胶底部0.6 cm左右，总共约6 h。

1.7 胶体染色与图像的扫描分析

电泳结束后，采用硝酸银染色方法染色[13]。胶片使用imagescan扫描，并用软件ImageMasterTM 2D Platinum 5.0进行图像分析。

1.8 蛋白质点胶内酶解及肽段提取

1.8.1 脱银 向取下的蛋白点加60 μL DD.H2O洗2～3次，10 min/次；加60 μL 100%乙腈，用漩涡振荡器振荡5 min，重复3次，脱水至胶粒完全变白，超净台吹干20~30 min；

1.8.2 胶内消化 加入新鲜配制的10 mM DTT（在990 μL 25 mM NH4HCO3加入10 μL 1M DTT 配制）20 μL溶液，57 ℃孵育1 h；冷却至室温，用枪头吸去残留液。加入20 μL 55 mM碘乙酰胺（55 μL 1M IAM，945 μL 25 mM NH4HCO3现配）20 μL溶液，置于暗室 60 min。吸弃上清，用100微升的移液器加入60 μL 100 mM NH4HCO3溶液，用漩涡震荡器震荡混匀，室温静置5 min，如此重复1～3次；用移液器吸弃上清，加入60 μL乙腈，漩涡震荡器震荡混匀，室温静置5 min，重复1次；吸弃上清，加入60 μL 100 mM NH4HCO3溶液，漩涡震荡器震荡混匀，室温静置5 min；接着弃上清，加入60 μL乙腈，漩涡震荡器震荡混匀，室温静置5 min，重复1次，超净台吹干30 min。加入15 μL消化液（12.5 ng/μL胰酶（50 mM NH4HCO3配制）溶液），混匀，4 ℃或冰上放置30 min；用移液枪吸出多余的液体，接着加入10 μL 50 mM NH4HCO3溶液，转速6000 rpm离心30 s，37 ℃消化12 h。

1. 9 质谱分析

1.9.1 上样 将其冷却至室温，转速6000 rpm离心5 min，用移液枪收集消化液于1.5 mL离心管中；用20 mM碳酸氢铵溶液补至溶液终体积为15~20 μL；将其转移至上样管；用于质谱分析。

1.9.2 LC MS/MS分析 LC MS/MS分析是在福建农林大学农业生态研究所进行的。LC条件：高效液相色谱仪：Thermo Scientific Surveyor System；色谱柱：BioBasic C18 Column (100×0.18 mm，particle size: 5 um)；样品量：10 μL；流动相：A: 0.1% Formic acid in water；B: 0.1% Formic acid in acetonitrile；梯度：5%~35% B in 20 minutes, 35%~95% B in 2 minutes；流速：2.5 μL/min；MS条件：质谱仪：LTQ-XL (Thermo Scientific)；喷雾电压：3.5 kV；毛细管温度：275 ℃；鞘气流速：15 arb；母离子扫描范围：400~2000 m/z；Isolation width：2 Da。二级质谱条件：AGC Target 1e4, 1 microscans；碰撞能量：35% CID。

1.10 数据库查询及蛋白质鉴定

质谱分析所获得的原始数据用Proteome Discoverer 1.2软件进行相对定量分析及数据库的检索。搜索使用的数据库为从NCBI下载的蛋白库。

2 结 果

2.1 不同种植方式烤烟根系差异蛋白质图谱

蛋白质双向凝胶电泳图谱见图1，在等电点从3.5到10和分子量为14 KD到116 KD的范围内，通过软件ImageMaster 5.0的分析，去除假点，每块胶大概有403个点左右。图谱清晰，蛋白质点圆而多。

2.2 差异蛋白质点的LC-MS/MS分析与鉴定结果

当对应上两点之间差异达到2倍以上，认为表达量有明显差异，在根系样品中检测到15差异点，对这15个差异蛋白质点进行LC-MS/MS分析和生物信息学查询后得到14个蛋白质点的质谱结果，见图1，11个已知蛋白，3个未知蛋白，见表2。这11个蛋白，复种连作下10个蛋白下调表达，编码分别是（2、25、35、43、44、48、49、50、52、53）；而只有1个蛋白上调表达，编码42。

根据各个蛋白的功能将鉴定到的11个蛋白分成以下5大类。

Ⅰ 与植物营养代谢相关蛋白 与植物营养代谢相关蛋白1个，即转酮醇酶（spot2:transketolase,TK）。

Ⅱ 与能量代谢相关蛋白 与能量代谢相关蛋白1个，为磷酸甘油酸酯激酶（spot50: phosphoglycerate kinase）。

Ⅲ 与植物抗性相关蛋白 与植物抗性相关蛋白有5个，包括线粒体内膜移位酶亚基Tim13（spot25: mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim13），核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白（spot44:NBS-LRR(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat)），杀虫晶体蛋白（spot43:I nsecticidal crystal protein）、单脱氢抗坏血还原酶（spot49: monodehydroascorbate reductase (MDHA)），DnaJ蛋白质（spot52: DnaJ protein）。

Ⅳ 与物质运输以及信号转导相关的蛋白 细胞内囊泡运输蛋白Sly1（spot35: Vesicle trafficking protein Sly1），O-甲基转移酶（spot48: O-methyltransferase- like protein），镁依赖性磷酸酶（spot42: Mg-dependent phosphatase）。

Ⅴ核酸代谢相关蛋白 核糖体蛋白质（spot53: Ribosomal protein-like protein）。

3 讨 论

转酮醇酶是在戊糖磷酸循环以及光合成的还原型戊糖磷酸循环中起着重要作用的酶，以焦磷酸硫胺素和Mg2+为辅基。此酶的作用是把磷酸酮糖上的乙酮醇基转移给磷酸醛糖。Schenk等[14]研究认为，催化2个碳原子单位从磷酸酮糖可逆地转移到磷酸醛糖上，促进磷酸六碳糖、五碳糖、四碳糖和三碳糖之间的可逆转换。转酮醇酶活性的微小下降即可导致植物生长速度下降、芳香族氨基酸和苯丙氨酸代谢产物的抑制[15]。芳香族氨基酸是烤烟香气的主要物质[16]，苯丙氨酸代谢途径是影响烤烟香味的主要次生代谢途径。本研究结果表明，复种轮作烤烟根系TK上调表达，可能有助于提高烟叶的香气，进而有助于品质提高，而复种连作下调表达，可能对品质的提高有影响。

磷酸甘油酸酯激酶是糖酵解途径中一个重要的酶，可催化1，3-二磷酸甘油转变为3-磷酸甘油酸，同时产生1个分子的ATP[17]。本研究结果表明，烤烟轮作与连作相比，烤烟根系磷酸甘油酸酯激酶上调表达，为烤烟根系生命活动提供能量，一定程度上说明，复种连作烤烟根系活力低，可能不利于根系对养分的吸收，烤烟生长较弱。

图1 不同种植方式下烤烟根系蛋白图谱

表 2 不同种植方式烤烟根系差异蛋白LC MS/MS质谱分析结果

注：丰度变化为软件根据蛋白质点的相对体积生成的数值。

抗坏血酸在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化的作用，抗坏血酸与植物的抗逆性呈正相关性[18]。在植物体内，抗坏血酸在抗坏血酸过氧化物酶的作用下，氧化生成单脱氢抗坏血酸。单脱氢抗坏血酸不稳定，在单脱氢抗坏血酸还原酶的作用下可重新转变成抗坏血酸[19]。因此，单脱氢抗坏血酸还原酶对于抗坏血酸的再生具有重要作用。而且抗坏血酸具有增强多酚类化合物稳定性的作用，多酚是烤烟中的一类重要物质，在烤烟的颜色、香气、吸味等形成以及烟气安全性方面都有重要影响；多酚本身不但具有弱的清香，而且在燃吸时产生的热解成分对烟气香味的形成有直接影响，可赋予烟气烤香和清甜香[20]。核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白，这是植物抗病基因中数量最多的一类[21]。热激蛋白具有分子伴侣功能，主要参与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解，在细胞生命活动中起着重要的作用[22]。DnaJ蛋白作为辅助蛋白通过激活热激蛋白的ATP酶活性而调控其活性[23]。本研究发现，复种轮作下这几个蛋白均上调表达，可能有助于增强烤烟的抗性和提高烟叶的香气，而复种连作下调表达，可能导致烤烟抗性弱，品质较差。

O-甲基转移酶催化甲基化反应，通常以S-腺苷-甲硫氨酸作为甲基的供体。O-甲基转移酶参与苯丙烷代谢途径，植物体内许多重要的次生性代谢物的合成多与甲基转移酶有关，如木质素和育儿酚都是甲基化衍生物，植物体内与耐盐能力有关的重要信号转导物质——芒柄醇也是在肌醇甲基转移酶作用下形成的[24]。木质素对维管植物的机械支持、水分运输和病虫害防御等具有重要作用[25]。细胞内囊泡运输蛋白Sly1在细胞内囊泡参与内质网和高尔基体之间的运输。本研究结果表明，复种轮作下烤烟根系O-甲基转移酶和细胞内囊泡运输蛋白Sly1上调表达，加快体内物质运输，可能有助于烤烟生长和香气的形成。磷酸酶是许多信号转导通路控制磷酸化所必需的，是一种能够将对应底物去磷酸化的酶。镁依赖性磷酸酶是涉及磷酸化作用重要的酶[26]，而磷酸化目的使蛋白的分子构象发生变化，造成酶活力的缺失或者获得。本研究发现，复种连作下镁依赖性磷酸酶上调表达，可能是连作障碍下，刺激了磷酸酶的活性，产生磷酸化作用，造成酶活力的缺失，但磷酸化或去磷酸化并不一定对应着酶的激活或抑制，而且一些酶有多个磷酸化位点参与激活或抑制的调控。这个有待后续实验进一步深入的研究。

核糖体蛋白质与核糖体RNA共同组成了核糖体，是合成蛋白质的细胞器。除参与蛋白质合成，核糖体蛋白质还具有广泛的核糖体外功能，如独立于核糖体外发挥调控基因转录、mRNA翻译、细胞的增殖、分化和凋亡等[27]。在本研究结果表明，轮作烤烟根系核糖体蛋白质上调表达，蛋白质合成增加，也许有利于烤烟的生长，而复种连作烤烟根系蛋白质合成少，同时调控基因转录以及细胞生长发育能力降低，可能不利于烤烟的生长。

4 结 论

复种轮作模式（烤烟-水稻→水稻-水稻→烤烟），鉴定到转酮醇酶、磷酸甘油酸酯激酶、单脱氢抗坏血酸还原酶、核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白、DnaJ蛋白、O-甲基转移酶、细胞内囊泡运输蛋白Sly1、核糖体蛋白质等蛋白，涉及烤烟香气的形成、营养代谢、能量转化、信号转导、物质运输、蛋白质代谢等多种途径，这些酶在复种轮作模式下均上调表达，由此可以表明复种轮作模式可能为烤烟的生长提供了良好而又相对稳定的环境，促进根系生长，进而促进烟草生长，可能有助于提高烟草的产量和品质，提高经济效益。而这些酶在复种连作模式（烤烟-水稻→烤烟-水稻→烤烟）均下调表达，可能影响烤烟生长，使得烤烟生长较弱，品质较差，经济效益较低。综上所述，复种轮作模式（烤烟-水稻→水稻-水稻→烤烟）有助于消减烤烟的连作障碍。

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Analysis of Root Differential Expression Proteins ofunder Two Planting Systems

YOU Chuihuai1,2, CHEN Dongmei1,2, HUANG Jinwen1, TANG Lina3, XU Zhibing1,2, ZHANG Zhongyi1,2, LIN Wenxiong1,2*

(1. Agro-ecological Institute, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Institute of Tobacco, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 3. Tobacco Agricultural Science Research Institute of Fujian Province, Fuzhou 350003, China)

Root differential proteomics was employed in this study to explore the impact of different planting patterns (multiple cropping rotation (MR) and consecutive monoculture multiple cropping (MC) modes) on growth of flue-cured tobacco (L). The results showed that a total of 15 protein spots had significant expression difference; 14 protein spots were identified by LC-MS/MS analysis and database searching. Among which, the function of 11 proteins were identified, three proteins were related to the aroma formation, i.e. transketolase, monodehydroascorbate reductase(MDHA), O-methyltransferase-like protein were up-regulated under MR, it was helpful probably to enhance the tobacco quality. While under the MC treatment, they were down-regulated, and the tobacco quality could be worse. Phosphoglycerate kinase, mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim13, NBS-LRR(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat), DnaJ protein, Vesicle trafficking protein Sly1, Ribosomal protein-like protein were involved in energy metabolism, plant antioxidation reaction, translocation of solute, metabolism of nucleic acid, respectively. They were very important for the growth development of tobacco and all up-regulated under MR treatments, probably increasing the yield and improving the quality of tobacco, and gaining better economic benefit. They were all down-regulated under MC, which may cause weak growth, low yield and poor quality of tobacco.

flue-cured tobacco; two-dimensional electrophoresis; differential proteomic

TS413

1007-5119（2014）01-0089-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.017

福建省烟草公司项目“福建烟区以烟为主耕作制度研究”{闽烟合同[2006]18号}，“福建清香型烟叶适宜区生态基础研究”（闽烟合同[ 2010]-036）

尤垂淮，男，博士研究生，研究方向为烟草生理生态和栽培技术。E-mail：you123chui@163.com。

通信作者，E-mail：wenxiong181@163.com

2013-01-05

2013-10-10