硫化氢对离体大鼠急性缺血心肌心功能的影响

谢英花，马燕山，张 楠，张建新

（1.河北科技大学药学系，河北石家庄 050018；2.石家庄市中医院放射科，河北石家庄 050051；3.河北省医学科学院，河北 石家庄 050021）

H2S生理功能众多，尤其在心血管系统中发挥重要的调节作用［1］。已有研究表明，H2S可拮抗心肌缺血/再灌注损伤［2－4］。但对急性心肌缺血损伤的影响报道较少。本研究观察外源性NaHS对离体灌流大鼠心脏急性缺血损伤的影响，去除神经、体液的控制，为急性心肌缺血损伤的保护提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与主要试剂NaHS、5′-磷酸吡哆醛、2，3，5-氯化三苯四氮唑、Evan′s蓝均购自美国Sigma公司；考马斯亮蓝试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器八道生理记录仪Powerlab/8s（澳大利亚AD Instrument公司）；电动匀浆器Silentcrusher M（德国Heidolph公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；分析天平 METTLER-AE240、分析天平METTLER-PL203（瑞士梅特勒公司）；全波长酶标仪（美国BIOTEK公司）；恒温水浴箱（余姚市东方电工仪器厂）；SHA-C恒温振荡器（常州国华电器有限公司）

1.3 动物SPF级♂SD大鼠，体质量（270±20）g，由河北省实验动物中心提供。在恒温（21～23）℃、恒湿（45%～65%）、各12 h明暗周期的饲养室。

1.4 模型制备Langendorff灌注装置建立大鼠急性心肌缺血损伤模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg·kg－1麻醉后，迅速开胸，取出心脏，置于盛有混合气饱和预冷K-H液的平皿中，清洗残留血液，经主动脉逆行插管，悬挂于Langendorff灌注装置，混合气饱和的K-H液恒压灌注。平衡20min，6-0线穿线，结扎冠状动脉左前降支，引起心肌急性缺血。

1.5 动物分组SPF级健康♂ SD大鼠208只，随机分为9组：①假手术组、②缺血30 min组、③缺血1 h组、④缺血2h组、⑤缺血3h组、⑥缺血4h组（I 4h）、⑦5μmol·L－1NaHS组（I＋LNaHS）、⑧10 μmol·L－1NaHS组（I＋MNaHS）、⑨20μmol·L－1NaHS组（I＋HNaHS），其中假手术组共80只（每个时间点16只），其余每组16只。缺血组结扎左冠状动脉前降支，假手术组只穿线但不结扎。NaHS低、中、高剂量组分别于心肌急性缺血2 h时更换为5、10、20μmol·L－1NaHS的灌流液，心脏缺血4 h。

1.6 心功能指标将球囊测压管经左心耳通过二尖瓣口插入左心室，调节球囊内双蒸水量使左心室舒张末压（LVEDP）为0.798～1.064 kPa。连接压力换能器，由Powerlab/8s八通道生理记录仪实时记录左心室内压上升/下降最大速率（±dp/dtmax），计算左心室发展压（LVDP），并测定冠脉流量（CF）。

1．7 心肌组织中H2 S含量的测定用系列浓度的NaHS绘制标准曲线。取左心室前壁组织，洗净，滤纸吸干，精密称定其质量，用50 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH 6.8）通过电动匀浆器制备10%（W/V）心肌组织匀浆，匀浆离心（4 000 r·min－1，4℃，10 min），取上清液。考马斯亮蓝蛋白定量后，移至试管中，加入醋酸锌（1%，0.5 ml），混匀，再依次加入7.2 mol·L－1盐酸 0.5 ml（含20 mmol·L－1N，N-二甲基－对苯二胺硫酸盐）、1.2 mol·L－1盐酸0.4 ml（含30 mmol·L－1三氯化铁）。静置20 min充分显色。加入三氯乙酸（10%，1 ml），蒸馏水（2.5 ml）至5 ml，离心（6 000 r·min－1，5 min），吸取上清。在波长670 nm处读取吸光度。根据已制作NaHS标准曲线计算心肌组织中H2S的含量，结果以μmol·g－1（protein）表示［5］。

1．8 心肌组织中CSE活性的测定取左心室前壁组织处理，制备10%组织匀浆，离心吸取上清，检测CSE活性。反应在25 ml锥形瓶中进行，反应液1 ml，含磷酸钾缓冲液（pH 7.4，100 mmol·L－1）、L-半胱氨酸（10 mmol·L－1）、5′-磷酸吡多醛（2 mmol·L－1）0.9 ml，10%组织匀浆 0.1 ml。在中央室中加入醋酸锌（1%，0.5 ml），折叠放入滤纸（2 cm×2.5 cm）以加大吸收面积。锥形瓶在封口前用氮气充盈30 s，转移到37℃恒温摇床中反应90 min，注入三氯乙酸（50%，0.5 ml），继续孵育60 min终止反应。将中央室液体加入3.6 ml蒸馏水，7.2 mol·L－1盐酸 0.5 ml（含 20 mmol·L－1N，N-二甲基 －对苯二胺硫酸盐），1.2 mol·L－1盐酸0.4ml（含30mmol·L－1三氯化铁），混匀，室温静置20 min。在波长670 nm处读取吸光度。根据已制作NaHS标准曲线计算心肌组织中H2S的生成率，即组织中CSE活性，结果以 μmol·min－1·g－1（protein）表示［6］。

Fig 1 Changes of cardiac function at different time points after ischem ia

1.9 心肌梗死体积测定采用Evan′s蓝和TTC双染法检测心肌梗死体积。实验结束取心脏，经主动脉逆行灌注1 ml 1%伊文思蓝，缺血区不染色，非缺血区染为蓝色。再将心脏冷冻于－80℃冰箱30 min，取出，将其从心尖到心底横向切成6片约2 mm薄片，放入1%TTC染液中，37℃避光孵育15 min。正常区为蓝色，梗死区为灰白色，缺血非梗死区为砖红色。10%甲醛溶液固定，拍照，Photoshop软件计算梗死体积。

Fig 2 Effect of H 2 S on cardiac function in rats after ischem ia

1.10 数据处理实验结果以±s表示，通过SPSS13.0统计软件进行多组间单因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2 结果

2.1 离体心肌心功能指标的变化假手术组、缺血30 min、1、2、3、4 h组各组心功能指标在平衡期间无明显差异，与相应假手术组比较，缺血30 min、1、2、3、4 h组 ±dp/dtmax、LVDP、CF明显降低（P＜0.01）（Fig 1）。与缺血4 h组比较，I＋NaHS低、中、高剂量组 ±dp/dtmax、LVDP、CF明显升高（P＜0.05或P＜0.01）见 Fig 2。

2．2 离体心肌组织中CSE的活性及H2 S的含量的变化假手术组CSE活性和H2S含量在灌流平衡后30 min～4 h无明显变化。与相应假手术组比较，缺血30 min组CSE活性和H2S含量无明显变化，随着缺血时间的延长，缺血1、2、3、4 h组CSE活性和H2S含量均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）（Fig 3）。与缺血4 h组比较，I＋NaHS低、中、高剂量组CSE的活性和H2S的含量明显升高（P＜0.05或P＜0.01）见Fig 4。

Fig 3 Changes of the content of H2 S and the activity of CSE at different time points after ischem ia

Fig 4 Changes of the content of H 2 S and the activity of CSE in cardiac tissue after ischem ia

2.3 离体心肌组织梗死体积的变化与相应假手术组比较，缺血30min组无明显梗死灶，缺血1 h组可见明显梗死灶（P＜0.01），随着缺血时间的延长，缺血2、3、4 h组梗死体积明显增大（P＜0.01）（Fig 5，6）。与缺血4 h组比较，I＋NaHS中、高剂量组梗死体积明显减小（P＜0.01）（Fig 7，8）。

3 讨论

冠心病发病率高［7－8］、死亡率高，是三大人类死亡病因之一。因此，减轻心肌缺血损伤亟待解决［9－11］。在心血管系统中，H2S主要由成纤维细胞、血管内皮细胞、心肌细胞通过CSE催化分解L-半胱氨酸生成，并具有重要的生理、病生理学作用［12－14］。越来越多的研究表明，CSE活性、H2S浓度及心血管疾病密切相关［2，15－17］。

本研究发现缺血30 min时，离体大鼠心肌组织中，CSE活性和H2S含量与假手术组相比无明显变化，但缺血1、2、3、4 h组大鼠心肌组织CSE活性和H2S含量均明显降低。表明在离体急性缺血心肌组织中，CSE活性的降低引起H2S的生成减少，H2S/CSE体系下调出现心肌缺血损伤并不断加重，H2S/CSE体系可能参与了离体心脏急性缺血损伤的发生。

Fig 5 Representative images of the infarct volumes at different time points after ischem ia

Fig 6 Changes of the infarct volumes at different time points after ischem ia

反映心功能的指标中，LVDP及＋dp/dtmax体现心脏的收缩性能，－dp/dtmax体现心脏的舒张性能［18］。本研究结果显示，心肌缺血后，与相应假手术组相比，其 LVDP、±dp/dtmax明显下降，提示心肌收缩功能降低，心功能出现障碍。H2S是一种新型内皮舒张因子［19－20］，其生成受到抑制或下调会产生相反的效应。本研究也证实了这一点，心肌缺血后，与相应假手术组相比，其冠脉流量明显降低。

Fig 7 Representative images of the infarct volumes in each group

Fig 8 Effect of H2 S on the infarct volumes after ischem ia

梗死体积大小对急性心肌梗死患者的预后影响重大。其各项心功能指标的变化和恢复情况都与心肌梗死体积呈负相关。左心室舒缩功能的降低随左心室心肌梗死体积增大而更加明显，且预后更差［21］。因此，能否缩小心肌梗死体积是抗心肌缺血药物的主要疗效指标之一。本实验观察到缺血30 min时离体心肌组织无明显梗死灶，缺血1 h梗死明显，且随着缺血时间的延长，梗死体积明显增大。这与H2S/CSE体系、心功能指标、冠脉流量等的变化一致。提示外源性补充硫化氢可能改善急性心肌缺血损伤。

参考相关文献［22］和前期工作确定了 NaHS（H2S供体）的给药剂量及方法，观察H2S能否保护急性缺血损伤心肌，NaHS在水溶液中可解离为Na＋和 HS－，后者结合 H＋生成 H2S。实验结果显示，离体急性缺血损伤心肌在连续灌流含NaHS灌流液2 h后，低、中、高剂量组离体心肌中CSE的活性和H2S的含量可不同程度上升，左心室血流动力学指标明显改善，心肌梗死体积明显缩小，且有剂量依赖关系，提示外源性补充H2S可减轻急性心肌缺血损伤。这与以往研究结果一致［23－24］。

综上所述，内源性H2S/CSE体系可能参与了急性心肌缺血损伤的发生和发展，同时NaHS后处理能够减轻急性心肌缺血损伤。提示H2S在急性心肌缺血后早期治疗上可能具有一定的的临床价值。其作用机制是一个相互联系、相互影响的复杂调控网络，有待进一步研究。

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