外源性硫化氢抑制ox-LDL诱导血管内皮细胞组织因子的表达与降低ROS产生和抑制NF-κB活化有关

邓华菲，任 重，唐伟军，李雪飞，谭玉林，唐志晗，刘录山，王 佐，姜志胜

（1.湘南学院病理生理学教研室，湖南 郴州 423000；2.南华大学心血管病研究所，湖南 衡阳 421001）

急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是心血管疾病患者死亡的重要原因之一，而动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）斑块破裂及随后的血栓形成是ACS发生的病理基础。组织因子 （tissue factor，TF）即凝血因子Ⅲ，是凝血因子Ⅶ的辅因子和受体，是启动外源性及内源性凝血过程的重要因子。研究显示，ACS患者血浆中TF抗原水平及其活性明显高于稳定性心绞痛患者和正常人，血浆TF水平是ACS患者预后的重要预测指标［1］。正常状态下内皮细胞并不表达TF，但能被多种As危险因素，如氧化型低密度脂蛋白（oxidative low-density lipoprotein，ox-LDL）诱导表达［2］。既然 TF与 ACS的发生发展密切相关，抑制TF的产生可能是阻止ACS发生发展的有效途径。

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是继 NO和 CO之后的又一气体信号分子。与NO和CO相似，H2S具有调节血压［3］、抑制血管平滑肌细胞增殖［4］、降低脂质过氧化［5］等心血管药理作用。临床研究发现H2S水平降低与冠心病的病情、冠脉血管病变、冠心病危险因素等密切相关［6］。内源性H2S产生减少加速了As的发生发展［7］，而应用外源性H2S可以延缓ApoE基因敲除小鼠As的进程［8］。最近我们发现，外源性H2S能抑制ox-LDL诱导内皮细胞凋亡和巨噬细胞内脂质蓄积［9－10］。本室前期工作表明H2S可明显降低ox-LDL诱导内皮细胞TF表达［2］。本实验探讨外源性H2S抑制ox-LDL诱导内皮细胞TF表达的机制，为H2S用于临床防治心脑血管血栓性疾病提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料NaHS（H2S供体）购自Sigma公司，ox-LDL购自广州奕源生物科技有限公司，TF和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成，RT-PCR试剂盒购自Promega公司，Taq PCR MasterMix和DNA marker购自北京天根公司。TF ELISA试剂盒购自美国RD公司。N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）购自美国 Amresco公司，BAY 11-7082，NF-κB p65抗体、组蛋白 H3（Histone H3）抗体、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天有限责任公司。

1.2 细胞培养及分组HUVEC-12购自中南大学湘雅医学院实验中心，用含10%胎牛血清DMEM培养液培养，2～3 d更换培养液并传代。选择对数生长期细胞用于实验，实验前24 h换无血清培养液进行同步化后分组处理。①正常对照组：DMEM培养液培养24 h；②ox-LDL组：含50 mg·L－1ox-LDL的DMEM培养液培养24 h；③ox-LDL＋NaHS处理组：分别经 25、50、100及 200μmol·L－1NaHS培养 1 h，再与50 mg·L－1ox-LDL共同培养24 h；④NF-κB抑制剂组：经 10μmol·L－1BAY 11-7082预孵育1 h，再与50mg·L－1ox-LDL共同培养24 h；⑤抗氧化剂组：经 1 mmol·L－1NAC预孵育 1 h，再与 50 mg·L－1ox-LDL共同培养24 h。

1．3 RT-PCR法检测TF m RNA表达收集内皮细胞，用TRIzol提取细胞总RNA并融于无RNase水中，分别取0.2μg RNA用M-MuLV反转录酶合成cDNA。人 TF引物序列上游为 5′-AGAGGATAGAATACATGGAAACGC-3′，下游为 5′-CTAAAGCATGTTATGTGCAAAAGG-3′，产 物 长 度 210 bp。PCR反应条件为94℃预变性4 min，94℃变性30 s，56.5℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 32个循环，72℃继续延伸10 min。内参GAPDH引物序列上游为 5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，下游为 5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′，产物长度 697 bp。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共26个循环，72℃继续延伸5 min。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，拍照电泳条带并分析。每组实验重复3次。

1．4 ELISA检测TF蛋白含量在37℃与－80℃间反复冻融细胞3次以获取细胞冻融液检测TF蛋白含量。采用双夹心ELISA法测定TF蛋白，将被测蛋白结合在吸附于固体测定板上的多克隆抗体，然后加入酶连接的单克隆抗体，该抗体与已被多克隆抗体结合的蛋白结合，再加入发色底物，于15 min内用酶标仪测定各管吸光度（OD值）。以不同浓度TF标准品为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各种样品的浓度。

1．5 DCFH荧光分光光度法检测细胞内ROS含量

DCFH-DA本身没有荧光，能自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，后者不能通过细胞膜。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光可以反映细胞内活性氧的水平。接种于12孔培养板上的细胞经各因素干预后，用0.1 mol·L－1的PBS（pH＝7.4）洗3次，然后经0.25%的胰蛋白酶消化，无血清DMEM吹打，制成单细胞悬液，1 000 r·min－1，离心5 min，弃上清，再用无血清 DMEM洗1次后弃上清，用稀释好的DCFH-DA重悬细胞（终浓度为10μmol·L－1），37℃孵育 20 min后用无血清的DMEM洗3次，去掉未进入细胞内的DCFHDA，30 min后用荧光分光光度计检测其荧光强度（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

1．6 核蛋白的提取和NF-κB活化的检测在冰上进行核蛋白的提取，BCA法定量蛋白浓度。配制10%SDS-PAGE分离胶和5%积层胶，蛋白样品加入到5×SDS凝胶上样缓冲液中，在沸水中煮5 min使蛋白变性，然后每孔加入20μg核蛋白，10%SDSPAGE电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶的TBST室温下封闭2 h，再分别与NF-κB，p65抗体（稀释浓度为1∶300）或组蛋白H3抗体（稀释浓度为1∶500）4℃孵育12 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释浓度为1∶1 000）室温孵育2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，加发光剂显影、定影、洗片后进行图像分析，结果用灰度比值表示。

1.7 统计学分析所有数据用±s表示。SPSS 19.0进行统计处理，组间比较采用方差分析及t检验。

2 结果

2．1 NaHS对 ox-LDL诱导TF m RNA表达和蛋白含量的影响与正常对照组相比，50 mg·L－1ox-LDL明显增加了HUVECs TF mRNA的表达和蛋白含量，分别增加了8倍和7倍；不同浓度NaHS明显抑制了ox-LDL对HUVECs中TFmRNA和蛋白表达的诱导作用，分别抑制了12%、31%、64%、82%和13%、32%、62%、78%（Fig 1、2）。

Fig 1 Effects of different concentrations of NaHS on expression of HUVECs TF mRNA induced by ox-LDL（±s，n＝3）

Fig 2 Effects of different concentrations of NaHS on concentrations of HUVECs TF protein induced by ox-LDL（±s，n＝3）

2．2 Bay11-7082和NAC对ox-LDL诱导TF m RNA表达和蛋白含量的影响NF-κB的抑制剂——Bay11-7082预孵育HUVECs 1 h，明显抑制ox-LDL诱导的TFmRNA表达和蛋白含量的增加，分别抑制了83%和79%；抗氧化剂——NAC也能明显抑制ox-LDL诱导HUVECs TFmRNA表达和蛋白含量的增加，分别抑制了75%和76%，两者的抑制效应与200μmol·L－1NaHS的抑制效果相似（Fig 3、4）。

Fig 3 Effects of Bay11-7082，NAC and 200μmol·L－1 NaHS on expression of HUVECs TFm RNA induced by ox-LDL（±s，n＝3）

Fig 4 Effects of Bay11-7082，NAC and 200μmol·L－1 NaHS on content of TF protein in HUVECs induced by ox-LDL（±s，n＝3）

2．3 NaHS、Bay11-7082和 NAC对 ox-LDL诱导细胞内ROS产生的作用50 mg·L－1ox-LDL孵育内皮细胞24 h可以明显增加细胞内ROS水平，而不同浓度NaHS预处理可明显抑制ox-LDL诱导的细胞内ROS的增加，分别降低7%、21%、38%和55%（Fig 5）。NF-κB抑制剂 Bay11-7082和抗氧化剂NAC也明显降低ox-LDL诱导的细胞内ROS含量增加，分别降低57%和57%，它们对ox-LDL诱导ROS产生的抑制效应与200μmol·L－1NaHS的抑制效应相似。

Fig 5 Effects of different concentrations of NaHS，Bay11-7082 and NAC on ox-LDL-induced ROS content in HUVECs（±s，n＝3）

2．4 NaHS、Bay11-7082和 NAC对 ox-LDL诱导内皮细胞内NF-κB活化的影响与正常对照组比，50 mg·L－1ox-LDL孵育内皮细胞24 h使核内NF-κB p65的表达明显增加，而不同浓度NaHS预处理可明显抑制ox-LDL诱导核内NF-κB p65表达，分别抑制了 10%，25%，39% 和 57% （Fig 6）。NF-κB抑制剂Bay11-7082和抗氧化剂NAC也明显抑制了ox-LDL诱导细胞内 NF-κB p65表达，分别抑制了55%和55%，其效应与200μmol·L－1NaHS的抑制效应相似。

Fig 6 Effects of different concentrations of NaHS，Bay11-7082 and NAC on NF-κB activation induced by ox-LDL in HUVECs（±s，n＝3）

3 讨论

冠状As斑块溃疡、破裂基础上的血栓形成是ACS的重要发病机制。TF是凝血瀑布的主要启动因素，在动脉血栓形成中起关键作用。生理情况下，内皮细胞不表达TF，内膜中也检测不到TF抗原和mRNA，当内皮功能受损及某些病理情况下内皮细胞可产生大量TF。被释放的TF进入血液循环后与FⅦa形成复合物，激活凝血酶原和纤维蛋白原，从而促进血栓形成。

高脂血症是As的重要危险因素之一，其中低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）水平升高是高脂血症诱导内皮激活和损伤的主要因素。LDL发生氧化修饰形成ox-LDL后具有更强的损伤血管的能力，它施加了种种促As的作用，如促进血管平滑肌细胞增殖、诱导泡沫细胞形成，并作用于血管内皮，导致局部凝血功能紊乱。大量的ox-LDL蓄积于As斑块中时导致TF在破裂的斑块中表达明显增加，可见ox-LDL与As血栓密切相关。事实上，有研究报道ox-LDL能诱导培养的人脐静脉内皮细胞TF表达增强［11］，本研究也得到相似的结果，50 mg·L－1ox-LDL明显增加了HUVECs TF mRNA的表达和蛋白含量，因此，ox-LDL具有促进血栓形成的作用。ox-LDL诱导TF表达的机制尚不完全清楚，有研究报道ox-LDL通过氧化应激导致内皮细胞损伤［11］，而氧化应激在NF-κB的活化过程中起着非常重要的作用，NF-κB的活化诱导了 TF的生成［12］。我们研究发现ox-LDL增加TF mRNA和蛋白表达，伴随ROS产生的增多，而抗氧化剂NAC明显降低ox-LDL诱导的TF mRNA和蛋白表达，同时减少ROS的产生；本研究还显示ox-LDL增加TF mRNA和蛋白表达的同时，伴随 NF-κB的活化，而 NF-κB的抑制剂BAY 11-7082明显抑制了NF-κB的活化，同时降低了TFmRNA和蛋白表达，这些结果表明，ox-LDL通过ROS-NF-κB途径诱导TF的表达。

既然ox-LDL诱导ROS的产生，进而使NF-κB活化，导致了TF表达的增多，并最终促进血栓的形成。因此，清除 ROS，抑制 NF-κB的活化，降低 TF的表达，对于控制As和其他心脑血管疾病具有重要意义。大量研究表明，H2S具有重要的调节心血管系统的生理和药理作用［3－5］。本室研究发现，外源性H2S能抑制ox-LDL诱导内皮细胞TF表达［2］，但H2S对TF的作用机制尚不明了。最近有研究报道H2S是一种ROS的内源性清除剂。Muzaffar等［13］报道H S抑制TNF-α诱导的猪肺动脉内皮细胞产生。我们以前研究发现H2S抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡和巨噬细胞泡沫化，其机制与降低ROS的产生有关［9－10］。与这些结果一致，本实验也发现NaHS降低了ox-LDL诱导的内皮细胞ROS的产生。而且200μmol·L－1NaHS明显抑制ox-LDL诱导的TFmRNA和蛋白表达，其效应与抗氧化剂1 mmol·L－1NAC相似。NF-κB是以p50/p65异二聚体形式存在于细胞质中的快反应转录因子，与NF-κB的抑制性蛋白 （inhibitor kappaB，IκB）结合而呈非活性状态。当细胞受刺激后，IκB磷酸化并降解，NF-κB游离并迅速转移到细胞核内，诱导相关基因转录。通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内，就可以判断NF-κB是否被激活。本实验发现，预先用NaHS孵育能明显抑制ox-LDL诱导内皮细胞NF-κB p65核转位，200μmol·L－1NaHS的作用效果与 10μmol·L－1NF-κB抑制剂 BAY 11-7082相似。Wang等［14］研究发现NaHS抑制TNF-α诱导的IκB的降解和NF-κB核转位；NaHS处理自发性高血压大鼠明显降低了主动脉内皮细胞NF-κB p65的表达，同时增加 IκB-α的表达［15］。这些结果表明，H2S通过降低 ox-LDL诱导的内皮细胞ROS的产生和NF-κB的活化从而抑制TF的表达。综上所述，NaHS抑制ox-LDL对血管内皮细胞TF表达的诱导作用与其抑制ROS-NF-κB途径有关。

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