碱性成纤维细胞生长因子注射方式及剂量对大鼠外周神经损伤修复的影响*

刘焕兴，季日旭，麻光喜，沈新升，蔡仲卿，王苹

(浙江省温州市中西医结合医院 1.骨科；2.神经内科，温州 325001)

·药物研究·

碱性成纤维细胞生长因子注射方式及剂量对大鼠外周神经损伤修复的影响*

刘焕兴1，季日旭1，麻光喜1，沈新升1，蔡仲卿1，王苹2

(浙江省温州市中西医结合医院 1.骨科；2.神经内科，温州 325001)

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)靶肌内注射方式及剂量对大鼠外周神经损伤修复的影响。方法坐骨神经横断损伤模型大鼠45只,行神经显微缝合手术后分为A、B、C、D、E组,每组9只。A、B、C组手术后靶肌内单部位分别注射bFGF 800,400,200 U,D组多部位注射bFGF 200 U,E组(对照组)注射等量0.9%氯化钠注射液。手术后8周肌电图检查运动神经传导速度、肌肉动作电位幅值和肌纤颤电位波幅。结果各靶肌内注射bFGF组与对照组比较运动神经传导速度和肌肉动作电位波幅增加,纤颤电位波幅降低(均P<0.05)。多部位注射bFGF(D组)相比单部位注射bFGF组(C组)的运动神经传导速度和肌肉动作电位波幅增加,纤颤电位波幅降低(P<0.05)。不同剂量单部位注射bFGF组间的运动神经传导速度和肌肉动作电位波幅以及纤颤电位波幅差异无统计学意义(P>0.05)。结论靶肌内注射bFGF能促进大鼠神经再生,注射方式和有效剂量对神经修复有影响。

碱性成纤维细胞生长因子；损伤,神经；注射方式；药物剂量

周围神经完全损伤后,手术缝合对神经功能的恢复往往有限。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)是重要的神经营养因子。神经损伤后,bFGFmDNA及其蛋白的表达显著上调,神经胶质细胞数量快速增加,都能有效促进外周坐骨神经的损伤修复［1］。研究证实,周围神经损伤后,外源性bFGF是通过逆行轴浆运输方式到达神经节而对神经元起保护作用的［2］。又基于神经一般发出多条分支支配肌肉的现实,笔者尝试评估靶肌内注射bFGF的不同剂量和不同方式对治疗周围神经损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 选择清洁级成年SD大鼠(医学实验动物环境设施合格证号:医动字2203001)45只,体质量200～250 g,雌雄不限,由温州医学院动物实验中心［动物许可证号:SYXK(浙)2010-0150］提供。动物模型制备:大鼠经0.3%戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)腹腔麻醉,备皮,消毒后在无菌条件下进行手术。右下肢背侧部纵向切口,暴露股二头肌,经肌间钝性分离,游离坐骨神经,距梨状肌下缘1 cm处切断坐骨神经,用8-0显微缝线在显微镜下行神经外膜缝合。

1.2 模型制备 bFGF(珠海东大生物制药有限公司生产,批准文号:国药准字S10980077,剂型:溶液,规格:每瓶63 000 U)的活性成分为重组牛碱性成纤维细胞生长因子,4 000 U·mL-1。常规显微器械。Keypoint肌电诱发电位仪(丹麦)。

1.3 实验分组 制备以上45只大鼠坐骨神经横断损伤模型［3］,行神经显微缝合手术后分为5组,每组9只。A组为手术后靶肌内单部位注射bFGF 800 U,B组为单部位注射bFGF 400 U,C组为单部位注射bFGF 200 U,D组为多部位注射bFGF 200 U,E组为对照组,注射等量0.9%氯化钠注射液。手术后动物每周靶肌内注射2次,连续注射4周。

1.4 电生理测定坐骨神经传导速度 各组动物手术后8周麻醉,解剖出缝合后的大鼠坐骨神经,剪断沿途分支,记录电极采用针形电极,于距小腿(踝)关节上方1 cm处插入腓肠肌,用针插入大鼠尾部接地。两个刺激电极分别在神经的近侧端和远侧端测量神经传导速度,肌肉动作电位幅值。测量肌纤颤电位波幅时,针电极探入失神经肌肉,确定最大峰-峰波幅区域,移动针电极使波幅最大,记录最大纤颤电位波幅。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0版软件进行统计学分析,数据采用均数±标准差(±s)表示。采用单因素方差分析比较单部位注射不同浓度bFGF组的运动神经传导速度,肌肉动作电位波幅以及肌纤颤电位波幅,采用成组t检验比较不同方式组(C组和D组)的运动神经传导速度、肌肉动作电位波幅以及肌纤颤电位波幅。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组(A、B、C、D组)和对照组(E组)间的差异 手术后8周,各不同bFGF剂量和不同方式注射组相比注射0.9%氯化钠注射液组,其神经传导速度(图1)和肌肉动作电位幅值均增加(图2)(P<0.05)；最大纤颤电位波幅均减小(图3)(P<0.05)。此外,大体观察肌肉萎缩情况,对照组较各bFGF组肌肉萎缩更明显。

2.2 不同剂量组间(A、B、C组)的差异 经单因素方差分析,手术后8周,不同bFGF剂量注射组在运动神经传导速度(图1)、肌肉动作电位波幅(图2)和肌纤颤电位波幅(图3)均差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 5组大鼠手术后8周运动神经传导速度比较与E组比较,*1P<0.05;与D组比较,t=2.9,*2P<0.05Fig.1 Com parison of motor nerve conduction velocity am ong five groups of rats eight weeks after operationCompared with group E,*1P<0.05;compared with group D, t=2.9,*2P<0.05

图2 5组大鼠手术后8周肌肉动作电位波幅比较与E组比较,*1P<0.05;与D组比较,t=3.8,*2P<0.05Fig.2 Com parison of m uscle action potential am p litude among five groups of rats eight weeks after operationCompared with group E,*1P<0.05;compared with group D, t=3.8,*2P<0.05

图3 5组大鼠手术后8周肌纤颤电位波幅比较与E组比较,*1P<0.05Fig.3 Comparison of muscle fibrillation potential am p litude among five groups of rats eight weeks after operationCompared with group E,*1P<0.05

2.3 不同注射方式组间(C、D组)的差异 经成组t检验,手术后8周,不同bFGF方式注射组间在运动神经传导速度(图1)和肌肉动作电位波幅(图2)差异有统计学意义(P<0.05)；A、B、C、D组肌纤颤电位波幅(图3)组间差异无统计学意义(P>0.05),但与E组比较均差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

bFGF具有生物活性［4］,能保护受伤神经元,促进轴突再生,促进许旺细胞分裂增殖,但成纤维细胞生长因子的应用受自身生物学特性和外界环境的影响相当大,在神经损伤周围应用时蛋白的稳定性和生物活性不容易保持。研究证实,周围神经损伤后,外源性bFGF是通过逆行轴浆运输方式到达神经节而对神经元起保护作用的［2］。GROTHE等应用125I-bFGF对bFGF在舌下神经内的运输方式进行了研究,发现125I-bFGF能沿舌下神经纤维逆向运输至舌下神经核。这种bFGF在体内逆向摄取的方式为体内bFGF参与修复神经损伤提供了一种可能。研究证实靶向肌内注射有助于外周神经损伤的修复［5-6］。

有效补充外源性bFGF能提高神经修复的能力,但是不同浓度bFGF对神经修复作用的研究报道较少。本实验证实靶肌内摄取bFGF的量用于逆向传导修复神经是有限的。高剂量bFGF相比低剂量bFGF在修复神经的效果相似。笔者推断靶肌肉逆向摄取外来bFGF的有效量往往小于200 U。这也要求以后研究外来因子靶向肌肉摄取逆向修复神经损伤时剂量不在多。

神经进入肌肉往往都是发出一系列的分支,之后再发出分支支配各个部分的肌肉。单部位注射外来因子使得游离的因子局限化,不能弥散到肌肉的各个部位,也不能为各个神经细分支所摄取。笔者尝试多部位注射bFGF,以达到神经损伤部位有效的神经修复效果。实验证实多部位相比单部位同剂量的bFGF注射神经修复效果更加明显。因此推断单根神经末梢吸收外来营养有限,往往需要多部位多根神经共同完成营养的吸收,以达到理想的神经修复效果。

运动神经传导速度和肌肉动作电位波幅是评价神经功能的重要指标。神经损伤后,神经功能丧失,神经显微修复后,神经功能获得了重建的可能,借助bFGF,传递至神经损伤部位,能保护神经元,促进神经再生,提高运动神经传导速度。同时,神经损伤后容易发生肌内失神经,继而出现肌肉萎缩。肌电图纤颤电位衡量失神经肌肉萎缩较为常用,肌细胞的纤颤电位为失神经肌细胞的特征性改变,研究显示纤颤电位波幅与肌萎缩状态相一致,可作为评估肌肉萎缩程度的定量指标［7］。本研究显示神经损伤手术后采用bFGF靶肌内注射治疗后仍存在肌肉萎缩现象,多部位有效量注射bFGF有助于神经再支配肌肉,预防肌肉萎缩。

本研究结合神经发出分支支配肌肉的解剖学特点,同时注重药物浓度,揭示了多部位有效量的注射bFGF,更适合于神经损伤的修复和延缓肌肉的萎缩。但本研究尚不能对外源性因子bFGF逆向修复神经进行定量,仍需进一步研究。

［1］OHLA M,SUZUKI Y,CHOU H,et al.Novel heparin/alginate gel combined with basic fibroblast growth factor promotes nerve regeneration in rat sciatic nerve[J].J Biomed Mater Res,2004,71A(4):661-668.

［2］沈彬,裴福兴.碱性成纤维细胞生长因子缓释微球促周围神经再生作用的研究进展[J].中华创伤杂志,2005,21 (3):233-236.

［3］吴银生,王冠华,徐华梓,等.嗅鞘细胞促进大鼠坐骨神经损伤后神经功能恢复[J].浙江创伤外科,2011,26(6): 721-725.

［4］李光辉,邹耘,夏仁云.碱性成纤维细胞生长因子促进创面修复的临床疗效[J].医药导报,2002,21(4):215-217.

［5］杨益宇,张长松,刘焕兴,等.碱性成纤维细胞生长因子结合静脉套接修复正中神经缺损[J].浙江创伤外科,2007, 12(1):1-2.

［6］姚成灿,姚平,吴昊,等.人碱性成纤维细胞生长因子缓释海绵促进大鼠外周神经损伤的修复[J].中国临床康复, 2005,21(9):86-88.

［7］姜广良,顾玉东,沈丽英.用纤颤电位波幅衡量失神经肌肉萎缩程度的临床研究[J].中华手外科杂志,1998,14 (4):218-221.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.002

Effect of In jection Site and Doseage of Basic Fibroblast Growth Factor on Rats Peripheral Nerve Regeneration

LIU Huan-xing,JI Ri-xu,MA Guang-xi,SHEN Xin-sheng,CAI Zhong-qing,WANG Ping
(1.Department of Osteopaedics;2.Department of Neurology,Traditional Chinese Medicine Hospital of Wenzhou Ctiy,Wenzhou 325001,China)

Objective To explore the effectof administrationmethod and dosageof basic fibroblastgrowth factor(bFGF) on rats peripheral nerve regeneration.MethodsA total of 45 rats were injured by sciatic nerve cut and sutured.Nerve microscopic suturewas applied to repair nerve before rats were divided into five groups.After operation,groups A,B,C were injected with 800,400,and 200 U of bFGF solution in themuscle,respectively.For group D,200 U was injected inmultiple sites. For group E,equivalent salinewas injected.Motor nerve conduction velocity,muscle evoked action potential and fibrillation potential amplitudewere evaluated by electromyography 8 weeks after the operation.ResultsCompared with the control group,themotor nerve conduction velocity and muscle evoked action potential were significantly higher in the groups of bFGF and the fibrillation potential amplitude was lower in bFGF groups(P<0.05).Themultiple-site bFGF injection showed remarkably highermotor nerve conduction velocity,muscle evoked action potential and lower fibrillation potential amplitude(P<0.05).No significant difference was showen between groups of different doses of bFGF in motor nerve conduction velocity,muscle evoked action potential and fibrillation potential amplitude(P>0.05).ConclusionThe bFGF injected at targeted sites in muscle can promote nerve regeneration in rats.Themethod of administration and the dosemay influence the nerve regeneration.

Basic fibroblast growth factor;Injury,nerve;Route of adm inistration;Doseage of drug

R971;R965

A

1004-0781(2014)01-0005-03

2013-03-12

2013-07-23

*温州市科技局基金资助项目(Y2006A048)

刘焕兴(1970-),男,浙江温州人,主治医师,学士,主要从事医院骨科临床工作。电话：0577-88057025,E-mail：wzlhx@139.com。