葡萄汁组成对葡萄酒发酵过程中氨基甲酸乙酯含量的影响*

梁萌萌，薛洁，安荣，武运，赵彩云，王德良

1(新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐，830000)2(中国食品发酵工业研究院，北京，100015)3(北京龙徽酿酒有限公司，北京，100143)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate;ethyl urethane;carbamic acid ethyl ester，简称为EC)，又称为尿烷，是烟草叶及香烟的天然成分，也是发酵食品(如面包:酸牛奶、乳酪、酱油等)和酒精饮料(如葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等)的副产物，食品中含量非常低，一般在 ng/L到 mg/L之间［1－3］。20世纪40年代，Nettleship证明了EC具有致癌作用，可引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。现今EC被广泛用于工业涂料及动物麻醉［4］。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料。调查显示，如果人饮用氨基甲酸乙酯含量超过30 μg/L的酒［5］，那么患癌的机率会大大增加。

葡萄酒中EC是由前体物质(尿素、瓜氨酸等氨甲酰类物质)和乙醇自发反应产生的，尿素和瓜氨酸是通过酵母的尿素循环途径和苹果酸-乳酸菌的精氨酸脱亚氨基酶途径(简称ADI途径)代谢产生，其含量与葡萄汁或葡萄酒中精氨酸含量密切相关［6－7］。另外(NH4)2HPO4也是影响葡萄酒中EC含量的因素［9］。

精氨酸是葡萄汁中含量丰富且酵母可以利用的氨基酸。葡萄在栽培期间会喷洒尿素，而为了避免葡萄酒发酵时出现迟缓或停止现象，生产者会在发酵前添加氨盐。要控制葡萄酒中EC含量，了解前体物与EC间的量化关系以及它在葡萄汁中的最高限量非常重要。本研究分析了葡萄汁中精氨酸、尿素、瓜氨酸和(NH4)2HPO4对葡萄酒发酵过程中EC含量的影响，对从原料方面降低葡萄酒中的EC含量，提高葡萄酒的产品质量奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 模拟葡萄汁

储液A:在375 mL蒸馏水中加入葡萄糖100 g，果糖100 g，定溶至500 mL;储液B:在250 mL蒸馏水中加入 L-酒石酸6 g，L-苹果酸3 g，柠檬酸0.5 g;储液C:在250 mL蒸馏水中加入无氨基氮基础培养基1.7 g，肌醇6 mg，CaO 0.2 g，L-脯氨酸1 g，色氨酸0.1 g;将储液A、B、C混合后调节pH值为3.3。

酵母菌D254、乳酸菌VP41:由上海杰兔工贸有限公司提供;精氨酸、瓜氨酸:色谱纯，由百灵威公司提供。

1.1.2 仪器与设备

气质联用仪:美国PerkinElmer公司;安捷伦DBFFAP毛细管色谱柱(60 m ×0.25 mm×0.25 μm);strata FL-PR Florisil固相萃取柱:购于上海安谱科学仪器有限公司。

1.1.3 主要化学试剂

氨基甲酸乙酯(EC)(纯度＞99%)、内标物氨基甲酸丙酯(nPC)(纯度＞98%):Sigma公司、丙酮(色谱纯)、二氯甲烷(分析纯)。

1.2 分析方法

1.2.1 标准溶液的配制

称取0.100 0 g EC于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，配制成1 000 mg/L的储备液;再移取0.25 mL储备液至25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成10 mg/L的EC工作液。

称取0.100 0 g nBC(内标)于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，配制成1 000 mg/L的储备液;再移取0.25 mL储备液至25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成10 mg/L的nBC工作液。

1.2.2 样品前处理

移取0.25 mL配制好的 nBC内标工作液于25 mL容量瓶中，用酒样定容后混匀。取10 mL的正己烷于固相萃取柱上活化。

移取0.5 mL制备好的酒样于固相萃取柱上，静置5～10 min使酒样充分吸附后，缓慢过柱至干，流速为5滴/min左右，弃去流出液。

用2 mL的正己烷洗柱，弃去流出液。再用10 mL二氯甲烷进行洗脱，并用顶空瓶收集洗脱液，直至洗脱液流干。最后将收集液用氮吹仪氮吹至0.5 mL，转移至进样瓶，待进样分析。

1.2.3 色谱-质谱条件

升温程序:柱初始温度 60℃，保留 5 min，以4℃/min升温速率至150℃，保留2 min，再以8℃/min升温速率至222℃，保留2 min。

进样口温度:260℃;传输线温度:240℃;载气:氦气(99.999%);流速:1 mL/min;进样量:1 μL。不分流进样，2 min后，打开分流出口，分流流量30 mL/min。

1.2.4 样品检测

使用 EC工作液分别用二氯甲烷制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L 的 EC 溶液，加入内标，使其浓度均为0.4 mg/L nPC。制作标准曲线。

将处理好的试样，加入内标进样分析，利用标准曲线计算出试样中EC含量。

1.2.5 精氨酸的测定方法

采用PITC柱前衍生高效液相色谱法［10］。

1.2.6 尿素的测定方法

采用高效液相-荧光检测器法［11］。

1.3 工艺流程

根据模拟葡萄汁配方配制葡萄汁，接种酵母菌，接种量是0.8‰，放入20℃恒温培养箱中进行酒精发酵5 d，酒精发酵结束后，用滤纸过滤酒样，接种乳酸菌，接种量是0.05‰，在25℃恒温培养箱中进行苹果酸-乳酸发酵，发酵时间是30 d，发酵结束后，用滤纸过滤分离酒样，装瓶储存。

1.4 实验设计

在模拟葡萄汁中，分别添加不同浓度的精氨酸、尿素、瓜氨酸、(NH4)2HPO4，分析发酵过程中尿素和EC含量的变化。所有试验处理均设3个重复。

2 结果与分析

2.1 葡萄汁中精氨酸含量对葡萄酒中EC含量的影响

精氨酸作为重要的前体物质，在葡萄汁中的含量影响发酵结束后葡萄酒中EC的含量。本实验研究了7种不同含量的葡萄汁(见表1)在发酵过程及发酵后精氨酸、尿素和EC含量的变化，结果如图1、图2所示。

表1 发酵前葡萄汁中精氨酸的添加量Table 1 The additive amount of argnine in grape juice before ferment

图1 酒精发酵过程中精氨酸含量变化Fig.1 The changes of the argnine content during alcoholic fermentation

图1和图2结果显示，无论葡萄汁中初始精氨酸含量的高低，在整个发酵过程中精氨酸均呈现显著的下降趋势，发酵前2天降低幅度最大，葡萄汁中初始精氨酸含量越高，发酵结束后葡萄酒中的精氨酸含量也越高。尿素的变化与精氨酸相反，整个发酵过程中含量呈增加趋势，但图2也显示尿素的转化速度d［Urea］/dt在整个发酵过程中是不同的，其中发酵前3天增加速率最大，随后逐渐降低，这主要与部分尿素形成EC有关。

葡萄汁中初始精氨酸含量越高，发酵结束后葡萄酒中的尿素含量也越高，关系如图3所示。

图2 酒精发酵过程中尿素的含量变化Fig.2 The changes of the urea content during alcoholic fermentation

图3 葡萄汁初始精氨酸浓度与发酵后葡萄酒中的尿素含量间的关系Fig.3 The relationship between argnine concentration in grape juice and the urea content in wine after fermentation

葡萄汁中添加精氨酸，则发酵过程中尿素会大量积累，虽然后期会有一些尿素被利用，但发酵结束后葡萄酒中还剩余大量的尿素，尿素大量的积累阶段与酵母快速繁殖阶段基本一致。而且葡萄汁中初始精氨酸含量和发酵结束后尿素含量间呈显著的线性相关关系，两者间的关系为:［Urea］=0.018 3［Arg］+1.827 9，斜率为精氨酸-尿素转化率，该方程中存在正截距，也说明了除精氨酸外，发酵过程中还有其他物质参与到尿素的形成中。

根据资料报道，葡萄酒中EC含量与尿素浓度间呈正比例关系［15］，而精氨酸又直接影响尿素的含量，本研究分析了酒精发酵后精氨酸含量与EC生成量间的关系(图4)，结果表明EC与精氨酸含量间的关系为:［EC］=0.003 6［Arg］+5.984 9，两者间的相关系数为0.985 2，呈显著的相关关系。根据分析结果，未添加精氨酸的样品中EC含量为2.05 μg/L，低于方程的正截距5.984 9，说明了精氨酸代谢产生尿素是EC产生的途径之一，葡萄酒酒精发酵过程中也存在其他EC形成路径。

图4 葡萄汁初始精氨酸浓度与酒精发酵后葡萄酒中EC含量间的关系Fig.4 The relationship between argnine concentration in grape juice and the ethyl carbamate content in wine after fermentation

苹果酸-乳酸发酵过程中，苹果酸乳酸菌通过精氨酸脱亚氨基酶途径(ADI途径)产生的瓜氨酸是葡萄酒EC形成的另一个重要前体物质，在模式葡萄汁中，精氨酸可以被乳酸菌代谢，随后瓜氨酸被乳酸菌分泌到介质中，两者之间的关系为:瓜氨酸分泌率=0.032×精氨酸降解率+0.005，r=0.093，因此精氨酸含量也影响ADI途径EC的生成量，研究分析了酒精发酵和苹果酸乳酸发酵后葡萄酒中EC的含量，结果如表2所示。

表2 初始精氨酸含量不同的葡萄汁酒精发酵和MLF后EC的含量Table 2 The content of ethyl carbamate after alcoholic fermentation and MLF in grape juice which have different content of argnine

表2结果表明，在苹果酸-乳酸发酵过程中，葡萄酒中EC含量明显增加，增加幅度大于酒精发酵过程中EC的产生量，这主要是由于在此过程中不仅存在瓜氨酸与乙醇反应生成EC的过程，也存在酒精发酵后尿素与乙醇反应生成EC的过程，这两个过程均受葡萄汁中初始精氨酸含量的影响。葡萄汁中初始精氨酸含量与MLF后EC产生量之间的关系为:［EC］=0.0181［Arg］+10.7，相关系数为0.963 6，呈显著的相关关系，根据该方程，如果已知发酵前葡萄汁中的精氨酸含量，就可推算出发酵后葡萄酒中的EC含量。而且当精氨酸含量为1 000、1 500和2 000 mg/L时，发酵后的EC含量达到了32.72、38.08和44.04 μg/L，超出了欧盟现有的限量标准，因此发酵前应通过控制酵母营养盐的添加量或澄清处理等措施控制葡萄汁中的精氨酸含量。

2.2 葡萄汁中的尿素和瓜氨酸含量对葡萄酒中EC含量的影响

早在1988年，Ough［8］就指出葡萄酒中EC形成的主要前体物质是尿素和瓜氨酸［12－14］，但尿素、瓜氨酸含量与EC生成量间的关系如何，目前仍无研究报道。本试验在发酵前的模拟葡萄汁中分别添加了不同浓度的尿素和瓜氨酸，研究发酵过程中尿素、EC的变化趋势，结果如图5、图6所示。

图5 不同尿素含量的葡萄汁发酵过程中EC的变化趋势Fig.5 The variation trend of EC during fermentation in grape juice which have different content of urea

图6 不同瓜氨酸含量的葡萄汁发酵过程中EC的变化趋势Fig.6 The variation trend of EC during fermentation in grape juice which have different content of citrulline

在葡萄汁发酵前分别添加尿素、瓜氨酸，发酵过程中两者含量呈均下降趋势，而对应EC含量不断增加。图5显示无论初始尿素含量的高低，发酵前3天，EC增加幅度最为明显，这与尿素的变化趋势基本一致，在一定程度上也说明了尿素是EC的前体物质。未添加尿素的葡萄汁，发酵过程中产生的EC含量极少;葡萄汁初始尿素含量越高，产生的EC也就越多。而初始瓜氨酸含量不同的葡萄汁，整体变化趋势与尿素基本一致，但两者也存在明显差异，图形显示尿素与乙醇间的反应主要发生在酒精发酵过程，而瓜氨酸与乙醇的反应却主要发生在MLF过程中，这可能是由于尿素、瓜氨酸与EC间的反应存在竞争作用，尿素更容易与EC发生反应。

由于葡萄酒发酵过程中同时存在精氨酸脱羧生成尿素和尿素与乙醇反应生成EC两个过程，2.1结果表明精氨酸与发酵结束后EC的含量呈线性相关，则推测尿素与EC含量间也应该存在线性关系，图7、图8结果也正好如此，尿素与EC含量间的关系为［EC］=0.826 5［Urea］+1.833 1，平均 EC 产生量为1.017 2 μg/mg尿素，而瓜氨酸与间的关系为［EC］=0.1977［Citrulline］+6.659 2，平均 EC 产生量为0.305 5 μg/mg瓜氨酸。与精氨酸对EC影响的反应系数0.018 1相比，系数为0.826 5的尿素影响更为显著，因此在实际生产中应禁止将尿素作为酵母营养样直接添加到葡萄汁中。

图7 葡萄汁中初始尿素含量与EC产生量之间的关系Fig.7 The relationship between urea content in grape juice and the output of urea ethyl

图8 葡萄汁中初始瓜氨酸含量与EC产生量之间的关系Fig.8 The relationship between citrulline content in grape juice and the output of urea ethyl

2.3 葡萄汁中的(NH4)2HPO4含量对葡萄酒中EC含量的影响

葡萄酒在起酵阶段，酵母对含氮物质的需求量增加，因此生产中经常会添加一些氮源，本研究常用氮源(NH4)2HPO4对葡萄酒中EC含量的影响，其浓度分别为0、100、150、200、250 和300 mg/L，研究结果如表3所示。

表3 初始(NH4)2HPO4含量不同的葡萄汁酒精发酵和MLF后EC的含量Table 3 The content of ethyl carbamate after alcoholic fermentation and MLF in grape juice which have different content of(NH4)2HPO4

从表3数据可知，添加(NH4)2HPO4含量增加时，EC含量变化没有规律性，说明(NH4)2HPO4不直接参与EC的生成，主要是通过影响酵母的活性影响EC的生成量。虽然与精氨酸、尿素相比，(NH4)2HPO4影响非常有限，但从总的变化趋势来看，随着添加量的增加，EC含量也在增加，因此生产中还是应控制氨盐的添加量。

3 结论

(1)葡萄汁中的精氨酸通过影响发酵过程中尿素和瓜氨酸的含量而影响EC的产生量，精氨酸含量和发酵结束后尿素含量间呈显著的线性相关关系，两者间的关系为:［Urea］=0.018 3［Arg］+1.827 9;精氨酸和瓜氨酸之间的关系为:瓜氨酸产生率 =0.032×精氨酸降解率+0.005，r=0.093。

(2)葡萄汁中精氨酸含量直接影响发酵结束后的EC产生量，两者之间的关系为:［EC］={0.018 1}［Arg］+10.7，相关系数为0.963 6，根据该方程，如果已知发酵前葡萄汁中的精氨酸含量，即可大致推算出发酵后葡萄酒中的EC含量。

(3)当葡萄汁中精氨酸含量为大于1 000 mg/L时，发酵后的EC含量超出了欧盟现有的限量标准30 μg/L，因此发酵前应通过控制酵母营养盐的添加量或澄清处理等措施控制葡萄汁中的精氨酸含量。

(4)尿素和瓜氨酸直接影响葡萄酒中的EC含量，两者相比，尿素的影响更为明显，本实验中平均EC产生量分别为1.017 2 μg/mg尿素和0.305 5 μg/mg瓜氨酸，因此生产中应禁止将尿素作为营养盐直接添加到葡萄汁中。

(5)(NH4)2HPO4对EC的影响没有规律，而且影响幅度也很有限，但总的是呈增加趋势。

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