响应面分析法优化松萝多糖提取工艺的研究

孙长霞，苏印泉，张柏林

(1.北京林业大学理学院，北京100083;2.西北农林科技大学林学院，陕西杨凌712100;3.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083)

松萝是松萝科松萝属的一种地衣植物，在西藏，新疆，黑龙江等地均有分布。松萝具有清热解毒、止咳、化痰、消炎等功效，很早便被用于医药领域，研究表明地衣植物的活性一定程度上与地衣多糖的含量有直接关系［1－3］。近年来，据国外文献报道，地衣多糖具有很高的抗癌活性，而这种多糖的抗癌作用是通过提高健康细胞的免疫能力，抑制癌细胞的病态增殖，从而克服了一些抗癌药物对健康细胞的损伤副作用，即所谓的“中间宿主免疫性”［4－5］。目前已报道的松萝多糖提取受提取温度、提取时间等多个因素的影响，但已有模型只是简单的描述单个因素对松萝多糖得率的影响，各因素间交互作用描述的很少，为了更好的了解各因素间对松萝多糖得率的影响，有必要建立多个因素数学模型以描述对松萝多糖得率的影响［6－9］。本文通过响应面分析法进行实验设计和数据分析，研究了提取时间、提取温度、液/料比与松萝多糖提取含量之间关系的数学模型，并对模型进行了检验，为松萝的研究开发及中药现代化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粗皮松萝(Usnea.montis－fuji)2005年8月采自于陕西秦岭火地塘，经由西北植物所黎斌老师进行鉴定松萝科松萝属地衣植物，样品除去枯枝、叶梗、破损叶及其它地衣杂物后剪碎，置于真空干燥箱中在50℃条件下干燥12h，放入封口塑料袋中密封保存，备用。

乙醇，丙酮，氯仿等试剂均为分析纯;UV－2000紫外－可见分光光度计 河南兄弟仪器设备有限公司;SENOC－R旋转蒸发器 上海申生科技有限公司;DK－98－1型电热恒温水浴锅 广州北锐精密仪器有限公司;FA－2004型电子天平 上海恒平科学仪器有限公司;SHD－Ⅲ型循环水泵 北京中教金源科技有限公司;ZDF－5型真空干燥箱 南京天煌机械有限公司。

1.2 实验方法

以粗皮松萝为研究对象，采用脱脂后热水浸提法对粗皮松萝中的多糖进行提取，具体工艺流程如下:准确称取一定量的事先处理好的粗皮松萝样品，氯仿索氏提取至无色;然后热水浸提脱脂液、抽滤、减压浓缩、乙醇沉淀、乙醇和丙酮洗涤、真空干燥，得粗皮松萝粗多糖。

1.2.1 单因素实验 按照上述方法提取松萝多糖，选取液/料比(20∶1，30∶1，40∶1，50∶1)，提取温度(60、70、80、90、100℃)，提取时间(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00h)等因素进行单因素实验，以多糖提取含量为考察指标，探究各因素对松萝多糖提取含量的影响。在上述单因素实验确定的最佳提取时间、液/料比和提取温度下，准确称取一定量的粗皮松萝，然后考察浸提次数依次为1、2、3、4和5次时对松萝多糖提取效果的影响，以多糖提取含量作为考察指标，确定松萝多糖提取过程中的最佳提取次数。

1.2.2 中心组合实验设计 在上述单因素实验的基础上，选取松萝多糖提取过程中影响较大的3个因素［10－11］，提取时间、提取温度和液/料比作为考察因素，每个因素三个水平，采用响应面分析法建立三因素二次回归正交旋转组合设计实验。根据central composite design，CCD的中心组合原理设计实验［12－13］，设 3 个自变量 z1、z2和 z3分别代表提取温度、提取时间、液/料比，每个自变量的上、下水平分别为zri和z－ri，根据各实验因素的水平范围，按公式1进行编码，经过这种量纲唯一的编码转换，所有变量的取值都是+1和－1，它们在所研究的区域范围内都是平等的［14－15］，列出的因素水平编码表，结果见表2。

在此基础上，可以列出因素水平的编码表，结果见表1。

1.2.3 松萝多糖含量的测定(苯酚－硫酸法)本文采用苯酚－硫酸法［16］测定多糖含量，多糖含量计算公式如下:

松萝多糖含量(mg/g)=提取液松萝多糖浓度(mg/mL)×体积(mL)×稀释倍数/松萝样品质量(g)

1.3 实验数据统计与分析

所有实验数据重复测定3次，所得结果为平均值±标准差SD。实验结果利用 DPS 11.5，SPSS和MATLAB等数据分析和统计软件进行分析和处理［17－19］。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验优化工艺参数

本文采用苯酚－硫酸法测定多糖含量，吸光度与多糖含量(y)的方程为:y=0.009882x－0.028，相关系数为:R2=0.9933。按照1.3.1的方法进行单因素实验，结果见图1～图4。由图1～图4可知，当提取时间为 2.00h，提取温度为 80℃，液/料比为 20∶1，提取次数为2次时松萝多糖提取含量最大。

图1 提取时间对松萝多糖提取含量的影响Fig.1 Effect of extracting time on Usnea Polysaccharide yield

2.2 建立模型

以松萝多糖提取含量为响应值，采用多元二次回归方法对实验结果进行响应分析，实验设计及结果见表2。

表2中实验1～8为析因点实验，9～14为星号点的实验，15～23为中心点实验，其中析因点实验为自变量取值在所构成的三维顶点;星号点实验为自变量取值所构成的三维区域的中心点［17－19］;中心点实验重复9次，用以估计实验误差。利用DPS 11.5软件对表3数据进行多元回归拟合，获得响应值(y)对影响多糖提取含量关键因子(提取温度x1、提取时间x2和液/料比x3)的二次多项式回归模型见式(1)。

表3 回归方程的方差分析Table 3 The ANOVA of master regression equation

图2 提取温度对松萝多糖提取含量的影响Fig.2 Effect of extracting temperature on Usnea Polysaccharide yield

图3 液/料比对松萝多糖提取含量的影响Fig.3 Effect of ratio of sample to water(m/m)on Usnea Polysaccharide yield

图4 提取次数对粗皮松萝粗多糖提取含量的影响Fig.4 Effect of times of extraction on Usnea Polysaccharide yield

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Design and data of RSM experiment

对模型(1)进行方差分析及回归系数显著性检验，结果见表3。

由表3可知，x1x3项的回归分析对松萝多糖提取含量的影响不显著(α=0.05)，其他各项回归系数均在不同程度上显著;对回归方程的F检验结果极显著，这表明回归方程能够较好的代表实验结果的规律。剔除不显著项后的预测回归方程(2):

将二次回归正交旋转组合设计实验的因变量数值代入预测回归方程(2)进行拟合，结果见表2。由表2可以看出，不同实验条件下各拟合值与测定值之间误差较小，说明回归方程拟合状况良好。

利用DPS统计软件，在各因素的考察范围之内对松萝多糖的提取含量进行最大值求解。结果表明，提取温度在零水平(80℃)，提取时间在1.682(3.00h)，液/料比在 1.682(40∶1)时，松萝多糖提取含量最高，达到81.29mg/g。对求取的最佳提取条件进行实验验证，实验结果的平均值为80.16 mg/g，验证值接近预测值，误差小于5%。

按照编码值与实验值间的转换公式，将预测回归方程(2)中的编码值转换为实际值，可以得到用实际的实验参数来表示的松萝多糖提取含量回归方程(3)。

2.3 模型交互项分析

2.3.1 单因素效应 对预测回归模型进行方差分析，其F值大小依次是x2＞x3＞x1，即影响松萝多糖提取的各因素重要顺序依次为:提取时间、液/料比、提取温度。利用DPS 11.5软件对预测回归方程(3)进行单因素效应分析，结果见图5。

图5 提取时间、提取温度、液/料比对粗皮松萝粗多糖提取含量的影响Fig.5 Effect of extraction time，extration temperature，ratio of sample to water(m/m)on extraction efficiency of Usnea Polysaccharide

由图5可知，在松萝多糖提取过程中，粗多糖提取含量随提取温度的增加而增大，到达零水平附近(提取温度80℃)时松萝多糖提取含量最高;当提取温度再增加时，则松萝多糖提取含量反而下降。液/料比和提取时间对松萝多糖提取的影响是两条平滑上升且趋于平缓的曲线，液/料比和提取时间分别达到0.5水平附近(液/料比是32∶1，提取时间是2.21h)时粗多糖提取含量最高;而后随着液/料比和提取时间的增加，松萝多糖提取含量趋于平缓。

2.3.2 交互效应分析 利用DPS 11.5软件对预测回归方程(3)进行交互效应分析，结果见图6～图8。

图6 提取温度、提取时间对松萝多糖提取含量的影响Fig.6 Effects of extraction time，extraction temperature on Usnea Polysaccharide yield

图7 提取温度、液/料比对松萝多糖提取含量的影响Fig.7 Effects of extraction temperature，ratio of sample to water(m/m)on Usnea Polysaccharide yield

图8 提取时间、液/料比对松萝多糖提取含量的影响Fig.8 Effects of extraction time，ratio of sample to water(m/m)on Usnea Polysaccharide yield

由图6可知，在提取时间一定的情况下，松萝多糖的提取含量随着提取温度的增加呈现一种抛物线的规律，即在提取温度80℃之前，松萝多糖的提取含量随提取温度的增加而增大;当提取温度达到80℃之后，继续增加提取温度则松萝多糖提取含量反而下降。提取时间比较短的情况下，提取温度对多糖提取的影响表现的尤为显著。在图中所示的每一个提取温度下，松萝多糖提取含量随提取时间呈现一种不断增加的趋势，在提取时间2.50h之前，随着提取时间的延长松萝多糖提取含量增加;在提取时间超过2.50h之后，随着提取温度的增长松萝多糖提取含量缓慢下降。

从等值线图可以看出，随着提取温度和提取时间的增加，松萝多糖的提取含量迅速增加，提取温度和提取时间之间的交互作用比较显著。同时可以看出，在提取温度为77～86℃，提取时间1.80～2.50h这个区间之内，松萝多糖的提取含量最高(提取含量大于70.00mg/g)。

从图7可以看出，在提取温度一定的情况下，松萝多糖的提取含量随着液/料比的增加呈现一种抛物线的规律，即在液/料比达到30∶1之前，松萝多糖的提取含量随液/料比的增加而增加;当液/料比超过30∶1之后，继续增加液/料比松萝多糖提取含量反而降低。在图中所示的每一个液/料比下，松萝多糖提取含量随提取温度呈现一种不断增加的趋势，提取温度达到80℃之前，随着提取温度的升高松萝多糖提取含量逐渐增加;在提取温度超过80℃之后，随着液/料比的增长松萝多糖提取含量缓慢下降。

从等值线图可以看出，随着提取温度和液/料比的增加，松萝多糖的提取含量缓慢增加，提取温度和液/料比之间的交互作用比较显著。同时可以看出，在提取温度为 77～86℃，液/料比为 27∶1～40∶1，这个区间之内，松萝多糖的提取含量最高(提取含量大于70.00mg/g)。

从图7可以看出，在液/料比较低的情况下，松萝多糖的提取含量随着提取时间的增加而呈现一种不断增加的趋势。即随着提取时间的增加，松萝多糖提取含量逐渐增加。而在液/料比较高的情况下，松萝多糖的提取含量随提取时间的增加变化不大。同样在提取时间比较短的情况下，松萝多糖提取含量和液/料比之间也存在一种类似与抛物线的关系。即随着液/料比的增加松萝多糖的提取含量变化不大。但是在提取时间较长的情况下，松萝多糖提取含量随着液/料比的增加不断增加，与单因素实验结论一致。

从等值线图可以看出，松萝多糖的提取含量随着提取时间和液/料比的增加而显著增加，因此液/料比和提取时间之间存在着强烈的交互作用。在提取时间为2.41～3.00h，液/料比为 34∶1～40∶1 的情况下，松萝多糖的提取含量显现出最大值(大于70.00mg/g)。

3 结论

在单因素实验的基础上应用响应面分析法优化了松萝多糖的提取工艺参数，建立了松萝多糖提取含量与提取过程中的关键因素(提取温度、提取时间和液/料比)之间的二次多项式回归模型，经检验该模型合理可靠，同时利用该模型对松萝多糖提取过程中的关键因素进行单因素及交互效应分析，得出松萝多糖提取关键因素的优化参数为:提取温度80℃，提取时间 3.00h，液/料比40∶1 时，松萝多糖提取含量最高，达到80.16 mg/g。

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