高效液相色谱手性流动相添加法拆分阿卓乳酸对映体

张 虎， 沈芒芒， 童胜强， 颜继忠

（浙江工业大学药学院，浙江 杭州310032）

阿卓乳酸（atrolactic acid），又名α－甲基扁桃酸，是一种重要的非甾体消炎镇痛药合成中间体（其结构见图1），可用来合成多种2－芳基丙酸类药物中间体［1，2］，其活性成分主要存在于S型异构体中，而R型异构体活性甚微，甚至没有活性［3］。

关于阿卓乳酸对映体在手性色谱柱上的拆分或用毛细管电泳技术拆分的报道较多［4－9］。高效液相色谱（HPLC）技术有着良好的方法重复性，且可在制备型高效液相色谱上放大，但手性色谱柱价格普遍较高，适用性不广。而手性流动相添加法使用常规色谱柱，选择范围宽，在手性药物的拆分中被广泛应用。在阿卓乳酸对映体的拆分中有两篇报道［10，11］，其分别以铜离子与 L－氨基酸衍生物的配合物为手性添加剂或以白蛋白为配合剂与修饰后的色谱柱一起使用完成阿卓乳酸对映体的拆分，这两种手性流动相拆分方法的过程均需较为复杂的衍生化，且由于受到添加剂的影响使对映体的检测比较困难。环糊精及其衍生物作为高效液相色谱手性流动相添加剂，价廉易得，无需衍生化且一般不影响对映体的紫外检测，在手性化合物拆分中的应用日渐广泛［12－15］。

磺丁基醚－β－环糊精（SBE－β－CD）是阴离子型高水溶性环糊精衍生物，能通过范德华力、疏水作用、氢键等很好地与药物分子包合形成非共价复合物。本文以SBE－β－CD作为手性流动相添加剂，以C18柱为分离柱，采用HPLC拆分阿卓乳酸。考察了不同环糊精衍生物类型、SBE－β－CD的浓度、流动相pH和流速、柱温等因素对手性分离的影响，同时探讨了SBE－β－CD和阿卓乳酸对映体在HPLC中的包结机制。

图1 阿卓乳酸的结构式Fig.1 Chemical structure of atrolactic acid

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

岛津SCL－10AVP液相色谱仪，包括SPD10Avp紫外检测器、LC－10ATvp液相泵、AT－330柱温箱、CLASS－VP色谱工作站；Mettler－Toledo酸度计。

外消旋阿卓乳酸半水物购于东京化成工业株式会社（日本东京），含量大于97.0%；羟丙基－β－环糊精（HP－β－CD）、甲 基－β－环 糊 精 （Me－β－CD）、SBE－β－CD购于山东千汇精细化工有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；水为二次蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱：YMC－Pack ODS－A C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：含25 mmol／L SBE－β－CD 的0.1 mol／L 磷酸盐缓冲液（pH2.68，0.1 mol／L磷酸二氢钠溶液中滴加0.1 mol／L 磷酸溶液调节）－乙腈（90∶10，v／v）；流速：0.6 mL／min；柱温：30℃；紫外检测波长：220 nm；进样量：20μL。

1.3 实验方法

精密称取10.0 mg的阿卓乳酸对映体于25 mL容量瓶中，用流动相溶解、稀释至刻度，制成0.4 g／L标准溶液，于4℃冰箱中冷藏保存。临用前取适量上述标准溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即可在色谱条件下进行阿卓乳酸对映体的拆分。

2 结果与讨论

2.1 不同β－环糊精衍生物对手性分离的影响

实验中考察了 HP－β－CD、Me－β－CD 和 SBE－β－CD对阿卓乳酸对映体手性分离的影响，其他色谱条件不变。在水相（pH2.68，含20 mmol／L HP－β－CD）－乙腈（90∶10，v／v）条件下阿卓乳酸对映体没有任何分离迹象；减小乙腈的体积比，在水相－乙腈（98∶2，v／v）时或 增大手性 添加剂浓 度 至 25 mmol／L时，阿卓乳酸对映体也只有微弱的分离；将流动相有机修饰剂改为甲醇，在相同色谱条件下阿卓乳酸对映体无分离迹象且洗脱时间延长；将手性添加剂改为Me－β－CD，阿卓乳酸对映体同样无分离迹象；SBE－β－CD 作 为手 性添 加剂，在水相 （pH 2.68，含20 mmol／L SBE－β－CD）－乙腈（95∶5，v／v）条件下可拆分阿卓乳酸对映体，但洗脱时间较长；增大有机修饰剂比例至水相－乙腈（90∶10，v／v），可拆分阿卓乳酸对映体且大大缩短了洗脱时间。可以看出，用 HP－β－CD 和 Me－β－CD 作为手性添加剂无法拆分阿卓乳酸对映体，只有SBE－β－CD可拆分对映体。这可能是因为阿卓乳酸对映体分子的结构、大小与SBE－β－CD的空腔更为匹配。因此，本实验选择SBE－β－CD作为手性流动相添加剂。

2.2 手性添加剂浓度对手性分离的影响

SBE－β－CD的浓度对对映体分离的影响见表1。随着手性添加剂SBE－β－CD浓度在5～30 mmol／L范围内增大，阿卓乳酸对映体分离度逐渐增大。手性添加剂浓度的增大会增强其与对映体之间的相互作用，使阿卓乳酸对映体与SBE－β－CD生成的非对映体复合物之间的色谱行为差异扩大，因此增大了分离度。实验表明，在一定的SBE－β－CD浓度范围内，增大手性添加剂浓度，对映体的保留时间会缩短，但随流动相黏度的增大色谱柱压也会提高。综合考虑保留时间和分离度，选择SBE－β－CD的浓度为25 mmol／L。

表1 流动相中SBE－β－CD的浓度对阿卓乳酸保留因子k和分离度Rs的影响Table 1 Effect of the concentration of SBE－β－CD in mobile phase on the retention factor（k）and resolution（Rs）of atrolactic acids

Armstrong等［16］的研究表明，环糊精类衍生物与溶质间大多存在1∶1（少数情况2∶1）的包结关系。如SBE－β－CD与对映体间存在1∶1的化学计量关系，则对映体保留因子与SBE－β－CD浓度间应符合如下关系式：

其中k为对映体的保留因子；Φ为相比；［A］为液相色谱柱固定相的吸附点浓度；［CD］为SBE－β－CD的浓度；K为对映体与色谱柱固定相吸附点的结合常数；K1为对映体与环糊精形成1∶1包合物的包结常数。

将1／k 对SBE－β－CD的浓度［CD］作图，若为直线即符合公式（1），说明阿卓乳酸与SBE－β－CD形成1∶1的包合物。根据表1的数据分别以两对映体的1／k对SBE－β－CD的浓度作图（见图2）。得线性回归 方 程 依 次 为 1／k＋＝0.005 1［CD］＋0.121 7（R2＝0.999 7），1／k－ ＝0.004 3［CD］＋0.122 7（R2＝0.999 4），两条曲线都呈良好的线性关系，说明阿卓乳酸与SBE－β－CD形成了1∶1的包合物，且通过直线的截距和斜率得出了两个对映体与SBE－β－CD形成包合物过程中的包结常数分别为41.9和35.0 L／mol。

图2 1／k与手性添加剂SBE－β－CD浓度的关系Fig.2 1／k plotted against the SBE－β－CD concentration

2.3 流动相pH对手性分离的影响

流动相pH对手性化合物，特别是自身带有酸碱基团的化合物的分离有重大影响。如表2所示，在其他色谱条件不变的情况下，在pH2.5～4.0之间随着pH的增大，阿卓乳酸的保留时间不断减小，分离度也逐渐减小，pH2.5～3.0时可以达到完全分离。其原因可能是阿卓乳酸本身就是一种有机酸，含有可电离的羟基和羧酸基团，pH增大使其电离程度加大，与流动相中带负电的SBE－β－CD之间的静电作用力减弱，手性识别能力随之减弱，且其分子极性增加，在反相色谱柱上难以保留，洗脱时间也大大缩短。考虑到保留时间与分离度，选用pH2.68。

表2 流动相pH对阿卓乳酸分离度的影响Table 2 Effect of pH value of mobile phase on the resolution of atrolactic acids

2.4 柱温对手性分离的影响

考察了柱温（25～40℃）对阿卓乳酸对映体分离的影响。如表3所示，随着柱温的升高，阿卓乳酸对映体的分离度逐渐减小，保留时间略有缩短。原因可能是温度的升高使阿卓乳酸对映体与SBE－β－CD生成的非对映体复合物的稳定性下降，其色谱行为差异随之减小。考虑到保留时间与分离度，确定最佳柱温为30℃。

表3 柱温对阿卓乳酸分离度的影响Table 3 Effect of column temperature on theresolution of atrolactic acids

2.5 流速对手性分离的影响

在阿卓乳酸对映体的分离中，流速从0.40 mL／min逐渐增大到0.80 mL／min 时，阿卓乳酸对映体的保留时间逐渐缩短，峰宽变窄，但柱压不断增大，如表4所示。本文最终选取0.6 mL／min作为流动相的最佳流速。

表4 流动相流速对阿卓乳酸分离度的影响Table 4 Effect of flow rate of mobile phase on the resolution of atrolactic acids

2.6 方法重复性

在优化的色谱条件下分离阿卓乳酸对映体，结果见图3。进样6次，对映体的保留时间和峰面积的RSD均小于1.5%，说明该方法的重复性良好。

图3 HPLC拆分阿卓乳酸对映体的色谱图Fig.3 Chromatogram for enantioseparation of atrolactic acids by HPLC

3 结论

以SBE－β－CD为高效液相色谱流动相手性添加剂，拆分了阿卓乳酸对映体。本方法分离度好，灵敏度高，简便易行，且比手性固定相的方法更经济，易普及，为阿卓乳酸对映体的进一步深入研究提供了一种新方法。

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