超高效液相色谱－三重四极杆质谱联用方法测定血浆和尿液中的α－龙葵碱、α－卡茄碱和茄啶

张秀尧， 蔡欣欣， 张晓艺

（温州市疾病预防控制中心，浙江 温州325001）

α－龙葵碱（又名茄碱，α－solanine）和α－卡茄碱（α－chaconine）同属甾族生物碱的甙类化合物，为马铃薯生物碱的主要成分，约占块茎总生物碱的95%。茄啶（solanidine）为其甙元，在马铃薯中含量较低，又为α－龙葵碱和α－卡茄碱在人体内的代谢产物。这3种化合物的结构式见图1。新鲜马铃薯块茎的生物碱含量较低，约为20～100 mg／kg，目前认为含量在200 mg／kg 以下时可以安全食用［1］。如果马铃薯生长、采收和储藏条件不利会造成其生物碱含量增高。如光线照射、温度过高或机械性损伤都会造成生物碱含量增高，尤其在发芽后，幼芽和芽眼部分的生物碱含量更高，误食常会引起中毒。马铃薯总生物碱的人中毒剂量约为2 mg／kg 体重，3～6 mg／kg体重的剂量可能会危及生命。α－龙葵碱和α－卡茄碱是胆碱酯酶抑制剂，中毒初期会破坏胃肠道细胞产生肠胃炎，表现为呕吐、腹泻和腹痛等，引起出汗、呕吐、腹泻和支气管痉挛等症状，严重者意识丧失、呼吸麻痹或心力衰竭而死亡。α－龙葵碱、α－卡茄碱和茄啶不溶于水，不被水煮、烘焙、微波等烹调方法破坏，只有油炸才能显著去除［2－4］。

马铃薯生物碱的检测方法有液相色谱－紫外检测法［5－6］、气相色谱－质谱联用法［7］、基质辅助激光解吸电离－飞行时间质谱法（MALDI－TOF／MS）［8］、酶联免疫分析［9］、液相色谱－质谱联用法［10－14］等，以上方法多用于马铃薯样品的检测。对于生物体液样品，文献［15］报道的α－龙葵碱、α－卡茄碱和茄啶的检测方法为液相色谱法用于测定血清样品。由于待测物不含发色团，只能在低波长紫外检测，灵敏度低且干扰严重；血清样品需经固相萃取、离线氰丙基液相色谱富集和纯化，然后再经硅胶柱液相色谱分离于200 nm紫外检测，检出限为0.3 ng／mL，但操作烦琐，检测周期长，4天时间才能完成20份样品的检测。

目前生物样品中痕量有毒有害物质的确证检测首推液相色谱－三重四极杆质谱联用法［16－18］。本文对实验条件进行优化，建立了血浆和尿液中3种马铃薯生物碱的超高效液相色谱－串联质谱（UPLCMS／MS）测定方法，用于马铃薯中毒的快速检测。

图1 α－龙葵碱、α－卡茄碱和茄啶的化学结构Fig.1 Chemical structures ofα－solanine，α－chaconine and solanidine

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Acquity UPLC－Quattro Premier XE超高效液相色谱－串联质谱仪，配有电喷雾源、Masslynx 4.1工作站（美国 Waters公司）；ASPEC XL4 4通道全自动固相萃取仪（法国Gilson公司）；MS3旋涡混旋器（德国IKA公司）；N－EVAP氮吹仪（12孔，美国 Organomation公司）；Gradient A10 Milli－Q 超纯水器（Millipore公司）。

乙腈和甲醇（HPLC级，德国 Merck公司），甲酸（HPLC级，美国Tedia公司）；MCX固相萃取柱（30 mg／1 mL，美国 Waters公司）；α－龙葵碱和α－卡茄碱标准物质（美国Sigma公司），茄啶由发芽马铃薯提取的总生物碱经2 mol／L HCl 100℃水解3 h后再纯化制得，分别溶于甲醇配制成1.0 mg／mL标准贮备溶液（茄啶先溶于少量吡啶）；血浆来自温州市中心血站；尿液由健康人志愿者提供。

1.2 色谱条件

Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司），VanGuard BEH C18保护柱（5 mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司）；流动相A为0.1%（如无特殊说明均为体积分数）甲酸乙腈溶液，流动相B为含0.05%甲酸的5 mmol／L 乙酸铵水溶液。梯度洗脱程序：0～1.50 min，25%A～40%A；1.50～2.50 min，40%A～55%A；2.50～2.60 min，55%A～95%A；2.60～4.00 min，95%A；4.00～4.10 min，95%A～25%A；4.10 ～ 5.50 min，25%A。 流 速：0.300 mL／min；柱温：45℃；进样体积：10μL。

1.3 质谱条件

采用ESI正离子MRM模式。ESI毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：120℃；锥孔反吹气流量：50 L／h，脱溶剂温度：380 ℃，脱溶剂气流量：500 L／h，碰撞室氩气压力：0.352 Pa。其他参数见表1。

运行开始时，色谱柱流出液经6通切换阀切换至废液中直到1.20 min，质谱开始采集数据直到2.5 min结束，同时6通切换阀又将柱流出液切换至废液中。

表1 3种马铃薯生物碱的多反应监测参数Table 1 MRM parameters for the three glycoalkaloids

1.4 样品前处理方法

取250μL血浆或尿液样品加入250μL 2%甲酸水溶液，旋涡混匀，置于自动固相萃取仪的样品架中。MCX固相萃取柱依次用1.0 mL甲醇和1.0 mL水活化；以1.0 mL／min流速上样500μL样品溶液；分别用1.0 mL的2%甲酸水溶液和1.0 mL的甲醇淋洗（3.0 mL／min），抽干；3 mL含5%氨水的乙腈－甲醇溶液（6∶4）洗脱（2.0 mL／min）；洗脱液于55℃以氮气吹干，溶于500μL20%甲醇水溶液；过0.2μm滤膜，待测。

2 结果与讨论

2.1 质谱和色谱条件的优化

在电喷雾正离子检测方式下对质谱测定条件进行优化。先进行一级质谱分析（Q1扫描），得到3种待测物的准分子离子峰［M＋H］＋；然后对每种准分子离子峰进行二级质谱分析（子离子扫描），得到碎片离子信息，再对锥孔电压，碰撞能量等参数进行优化。遵循国际惯例，确证分析需要4个识别点［19］，要求选择2对分子离子对。α－龙葵碱和α－卡茄碱的子离子碎片较多，可以选择2对离子强度最高的分子离子对，而茄啶只有1个子离子碎片（m／z 98.1），故只能选用1对分子离子对。设定合适的峰驻留时间确保色谱峰的采样点数为15～20点，从而得到较好的定量重复性。

采用 UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）对流动相条件进行优化，结果发现0.1%甲酸乙腈溶液和含0.05%甲酸的5 mmol／L乙酸铵溶液作为流动相时，3种待测物的MRM响应最强，且峰形较好（见图2）。由于α－龙葵碱和α－卡茄碱具有相同的甙元，均含有3个单糖，分子结构非常相似，C18柱无法分离。考虑到α－龙葵碱和α－卡茄碱的定量离子对都具有相同的子离子（m／z 98.2），可能会存在质谱通道间子离子的交叉干扰（cross－talk）。因此在本实验条件下单独进样α－龙葵碱或α－卡茄碱，结果均未检出α－卡茄碱或α－龙葵碱，说明α－龙葵碱和α－卡茄碱虽然在色谱上没有分离开，但并不相互干扰。

2.2 样品前处理方法的选择

关于生物体液中的马铃薯生物碱测定的前处理，Hellenas等［15］采用Bond Elut C2固相萃取柱处理血清样品，属反相机理，再经氰基柱液相色谱富集和纯化，操作烦琐，前处理周期长。α－龙葵碱、α－卡茄碱和茄啶为碱性化合物，适合用MCX固相萃取柱进行样品前处理。样品酸化后生物碱带正电，可以被MCX固相萃取柱保留，经2%甲酸水溶液和甲醇淋洗去除杂质，最终用含5%氨水的乙腈－甲醇溶液（6∶4）洗脱。与用20%甲醇水溶液配制成的标准溶液相比较，尿液中α－龙葵碱、α－卡茄碱和茄啶的基质效应分别为122%、115%和124%，提取回收率分别为92%、95%和78%；血浆中基质效应分别为121%、120%和122%，提取回收率分别为88%、84%和76%。由于缺少同位素内标，本方法采用基质加标外标法定量，可抵消基质增强效应，方法简单、快速。

图2 空白血浆加标样品的MRM色谱图（10 ng／mL）Fig.2 MRM chromatograms of spiked blank plasma samples（10 ng／mL）

2.3 方法的线性范围和检出限

在空白样品中，加入适量标准溶液制作系列（6点）基质加标溶液，进行样品前处理，然后在选定的色谱和质谱条件下进行测定，基质空白均无干扰。采用Masslynx 4.1中Targetlynx组件，以定量离子对的峰面积对基质加标质量浓度进行回归（权重取1／x），血 浆 和 尿 液 中 3 种 待 测 物 在 0.3～100 ng／mL 范围相关系数均为0.997～0.999，符合线性关系的要求。在空白样品中添加低浓度的系列标准溶液，进行样品前处理后上机测定。α－龙葵碱和α－卡茄碱以2对分子离子对3倍信噪比的响应值对应的样品质量浓度作为检出限（LOD），茄啶以定量分子离子对3倍信噪比的响应值对应的样品质量浓度作为检出限（LOD），以10倍信噪比作为定量限（LOQ）。结果表明血浆和尿液中3种待测物的检出限均为0.1 ng／mL，定量限均为0.3 ng／mL。目前马铃薯中毒时血和尿中生物碱的浓度未知，Hellenas等［15］报道7名志愿者以0.4 mgα－龙葵碱／kg体重和0.6 mgα－卡茄碱／kg体重的剂量食用马铃薯。在食用5～6 h后，α－龙葵碱和α－卡茄碱在血液中的浓度达到峰值，血清中平均峰质量浓度分别为7.7 ng／mL 和14.4 ng／mL；而在食后8～25 h内茄啶达到峰值（1.0～4.8 ng／mL）。以上质量浓度均在本法的线性范围内，因此本法能够满足检测的要求。

2.4 精密度和加标回收试验

空白样品添加0.3、10和70 ng／mL 的3种待测物进行加标回收和精密度试验，结果见表2。血浆和尿液中的加标回收率分别为82%～112%和96%～114%，相对标准偏差分别为4.0%～16%和2.7%～17%（n＝6），符合痕量分析的要求。

2.5 样品的稳定性

分别用空白血浆和尿液加标，配制成含10 ng／mL的3种待测物的质控样品进行3次冷冻和解冻循环（－20℃至室温），测定并与新制备的样品进行比较，结果的相对偏差的绝对值均小于10%。含10 ng／mL的3种待测物的血浆和尿液质控样品的处理液置于自动进样瓶中，在样品室中室温放置24 h后与新处理的样品进行比较，结果的相对偏差的绝对值均小于8%。结果表明在上述条件下样品不会有明显的分解。

表2 血浆和尿液中3种马铃薯生物碱的加标回收率和相对标准偏差（n＝6）Table 2 Recoveries and RSDs of the three glycoalkaloids spiked in plasma and urine（n＝6）

3 结论

本文建立了一种超高效液相色谱－串联质谱方法快速测定血浆和尿液中的α－龙葵碱、α－卡茄碱和茄啶。通过样品的提取回收率和MCX SPE净化后目标物基质效应的评估，验证了样品前处理方法的有效性。通过优化液相色谱条件与质谱采集参数，得到了较佳的仪器检测条件。方法学考察表明，该方法具有简便、快速、灵敏等优点，可作为马铃薯中毒的快速检测方案推广应用。

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