液相色谱－串联质谱法测定食用植物油中的棉酚

张文华， 黄超群， 谢 文＊， 沈 立

（1.浙江出入境检验检疫局，浙江 杭州310016；2.上海出入境检验检疫局，上海200135）

棉酚（gossypol）是一种存在于棉花的棉籽及棉根皮中的多酚类物质。棉酚在棉籽初榨过程中转移至油中，粗制棉籽油中棉酚含量可达1%～1.3%［1］。长期食用棉酚较多的粗制棉籽油会引起中毒，影响生殖机能，导致不孕及胃肠障碍，甚至引起肺出血、呼吸困难等症状。棉籽油在其做成食用油前，必须经过精炼、漂白和去味3道工序，才能将其中的棉酚去除。由于棉酚毒性较大，国家标准GB2716－2005《食用植物油卫生标准》［2］规定食用植物油中棉酚的限量标准为0.02%（200 mg／kg）。近期台湾地区爆出“黑心油”事件后，台湾地区“卫生福利部”拟将食用油中棉酚的限量规定为1 mg／kg［3］。为了测定食用植物油中游离棉酚的含量是否超标，开展对食用植物油中游离棉酚含量的测定方法研究很有必要。

目前对棉酚的检测主要采用高效液相色谱法（HPLC）［4－6］、薄层色谱法［7］、紫外分光光度法［8，9］等。其中分光光度法测定时选择性不强，与棉酚有相似化学结构的物质均能被同时测定，使检测结果偏高；HPLC虽然得到广泛的应用，但低于1 mg／kg的棉酚含量已超出仪器的灵敏度极限。文献［10，11］采用液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）分别测定了鲜蛋黄和棉籽中的棉酚，而利用LC－MS／MS对食用植物油中棉酚进行检测的方法未见报道。本工作所建立方法的测定低限达到1 mg／kg，能满足目前市场的检测需求，同时还能用作HPLC确证阳性样品的辅助方法。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

Thermo TSQ Quantum Ultra液相色谱－串联质谱仪，配电喷雾电离源（ESI）（美国Thermo Fisher公司）；Surveyor液相色谱系统（美国Finnigan公司）；台式离心机（美国Thermo公司）；AE260电子天平（瑞士Mettler公司）；涡旋混匀器（上海医大仪器厂）；超纯水净化系统（英国ELGA公司）；微孔过滤膜（0.22μm，有机相）。

棉酚标准品：分子式为C30H30O8，相对分子质量为518.55，CAS No.303－45－7（上海安谱科学仪器有限公司），纯度为90.5%。准确称取经纯度折算后的棉酚10 mg，用丙酮溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1 g／L的标准储备溶液，进一步采用食用油的空白样品提取液稀释成质量浓度为10、20、40、60、100μg／L 的标准工作溶液（现配现用）。丙酮（色谱纯，美国TEDIA公司）；乙腈和甲酸（色谱纯，西班牙Scharlau公司）；水为超纯水；无水乙醇为分析纯。甲酸溶液（0.1%）：准确量取1 mL甲酸于1 L容量瓶中，加水并定容至刻度，混匀后备用。实验中所用其他试剂除特殊说明外均为分析纯。

1.2 样品前处理

准确称取1 g（精确至0.01 g）试样于50 mL离心管中，加入10 mL无水乙醇，剧烈振摇2 min，置于4℃冰箱中30 min，以4 000 r／min离心5 min后，取约2 mL上清液过滤。准确移取1.0mL，用无水乙醇稀释至10 mL，供LC－MS／MS测定。

1.3 LC－MS／MS检测条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5μm）；流动相：乙腈（A）－0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0～2.0 min，50%A；2.0～4.0 min，50%A～90%A；4.0～6.0 min，90%A；6.0～7.0 min，90%A～50%A；7.0～10 min，50%A。流速为0.30 mL／min；柱温为室温；进样体积为5 μL。

1.3.2 质谱条件

电离方式：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；扫描模式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：3 500 V；离子源温度：300℃；毛细管温度：270℃；碰撞气：高纯氩气，0.2 Pa；鞘气：高纯氮气，6.5 L／min；辅助气：高纯氮气，5.0 L／min。用于定量分析的离子对为 m／z 517.1／230.9（碰撞电压43 V）。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 标准品溶解溶剂的选择及稳定性的考察

棉酚是一种黄色不稳定的多酚羟基联萘醛类化合物，难溶于水、甘油、环己烷和苯，微溶于石油醚，易溶于无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、甲醇等有机溶剂。为了选择合适的标准品溶解溶剂，本文进行了优化实验。将10 mg／L 的棉酚分别保存在甲醇、丙酮、乙腈和乙醇中，连续测试5天，如图1a所示，发现棉酚溶解在丙酮中比较稳定，棉酚降解的幅度不明显。棉酚储存在乙腈、乙醇和甲醇中则不稳定，棉酚都有一定的降解，在甲醇和乙醇中尤为明显，这与文献报道相符［12，13］。因此选用丙酮作为配制标准品储备液的溶剂。

将棉酚溶解于丙酮中，配成10 mg／L 标准品溶液，于4℃下保存放置。将刚配制时所测得的棉酚峰面积和分别储存0、1、3、5、7、14、30、60天后的结果作图比较（见图1b），RSD为11.5%。从图1b还可以看出，棉酚标准溶液在14天之内比较稳定。

由于试样采用无水乙醇提取，因此用无水乙醇对标准中间液和工作液进行配制，同时对其稳定性进行考察。如图1c所示，10 mg／L标准中间液在24 h内一直处于降解过程，但6 h内降解幅度较小。因此只要保证检测在6 h内完成，对于结果的准确性还是可以得到保证。同时，由图1c可知，标准中间液及工作液需现配现用。

2.1.2 提取溶剂的选择

文献中有用丙酮［14］、无水乙醇［4－6］、70% （v／v）丙酮水溶液［15］、不同体积比的乙腈磷酸水溶液提取的报道。大多数文献都是采用无水乙醇提取。本文重点对上述几种溶剂的提取效率进行了考察比较。实验结果显示，4℃静置30 min后，丙酮与油互溶，70%丙酮水溶液与油形成乳浊液，无法实现对棉酚的有效提取。无水乙醇和乙腈与油有明显的分层，且提取效率在90%以上。相比乙腈而言，无水乙醇的毒性更小。因此，本实验采用无水乙醇进行提取。

图1 棉酚标准品溶液在（a）不同溶剂中5天内、（b）丙酮中60天内和（c）无水乙醇中24 h内的稳定性考察Fig.1 Stability test of gossypol standard in（a）different reagents during 5 d，（b）acetone during 60 d，and（c）alcohol during24 h

为获得最佳提取效率，本文同时考察了提取次数对提取效率的影响。结果显示，提取一次，棉酚的提取率为80.1%；提取两次，棉酚的提取率为83.3%；说明随着提取次数的增加，棉酚的提取率没有明显增加。为了简化实验步骤，本文采用单次提取方式。

2.2 质谱条件的优化

将棉酚标准溶液（10μg／L）在ESI源负离子模式下进行母离子全扫描，确定准分子离子峰；通过调节离子化温度、喷雾电压等参数后进行子离子扫描，同时对碰撞能量进行优化，得到两个干扰较小的子离子m／z 230.9和471.1。其中 m／z 230.9离子的响应更高，被选作定量离子，471.1为辅助定性离子。图2分别为棉酚的碎片离子质谱图和样品的色谱图。

图2 棉酚标准品的碎片离子质谱图和样品的多反应监测（MRM）色谱图Fig.2 Product ion mass spectrum of gossypol standard and MRM chromatograms of sample

2.3 方法的线性关系、准确度、精密度和灵敏度

2.3.1 线性关系

由于质谱在电离和扫描过程中存在基质效应的影响［16］，通常需采用内标法校正或基质匹配曲线［17］来消除或减弱基质效应。本实验测试了橄榄油、菜籽油、花生油和大豆油等不同种类植物油的基质效应，结果发现这些植物油的基质对棉酚离子化有很强的增强效应，而且差别不大。采用橄榄油空白样品溶液配制的标准工作液，其 m／z 517.1／230.9定量离子对响应为采用无水乙醇配制标准溶液的211%。因此，为消除样品基质效应，提高定量准确性，以食用油的空白样品提取溶液作为标准溶液的稀释溶液，可使标准溶液和样品溶液具有同样的离子化条件，从而补偿样品的基质效应。结果表明棉酚在10～100μg／L浓度范围均呈良好的线性关系，相关系数为0.999。如果样品中棉酚含量较高，处理后最终样液中浓度超过标准曲线范围，应用无水乙醇对其进行稀释。同时标准工作溶液应用稀释相同倍数的空白溶液进行配制。

2.3.2 回收率、精密度和测定低限

本方法对植物油中棉酚的测定低限为1 mg／kg，同时台湾地区和祖国大陆对植物油中棉酚的最低限量分别为1 mg／kg和200 mg／kg。因此在空白植物油中添加1、2、200 mg／kg 3个水平的棉酚标准溶液进行方法学考察（200 mg／kg添加水平下，样品稀释倍数适当加大），按优化条件提取并分析，每个添加水平平行测定6次。如表1所示，方法的平均回收率在87.4%～100%范围内，实验室内测定的精密度（以相对标准偏差（RSD）表示）小于10%。同时当空白植物油中添加1 mg／kg的棉酚时，方法的平均回收率为100%，RSD为9.8%，信噪比大于10，因此方法的测定低限被定为1 mg／kg。可见，该方法完全能满足植物油中棉酚的测定。

表1 植物油中棉酚的添加回收率与精密度（n＝6）Table 1 Spiked recoveries and precisions of gossypolin edible oil（n＝6）

3 结论

通过对影响液相色谱－串联质谱分离分析的主要因素进行优化和考察，建立了液相色谱－串联质谱法检测植物油中棉酚的分析方法。该方法测定低限为1 mg／kg，相比目前已见报道的分析方法，提高了灵敏度，也缩短了分析检测的时间。该方法快速简单，结果准确，重现性好。

［1］ Baidu Encyclopedia（百度百科）.（2007－05－29）［2014－01－20］.http：／baike. baidu. com／link？ url ＝ cYITcw－NkA8nhF6RAY6U71ToagC04IxOoCrNqBC8PNzGZb8＿AxxP－bIAhxPCWlqfh

［2］ GB2716－2005

［3］ Food Mate Net（食品伙伴网）.（2013－10－29）［2014－01－20］.http：／news.foodmate.net／2013／10／246990.html

［4］ Yu J Q.Science and Technology of Cereals，Oils and Foods（于加乾.粮油食品科技），2013，21（4）：78

［5］ Zhang Q Z.Guangzhou Chemical Industry（张庆珍.广州化工），2012，40（15）：159

［6］ Wen J，Miao H，Wang X J，et al.Chinese Journal of Health Laboratory Technology（文君，缪红，王鲜俊，等.中国卫生检验杂志），2006，16（8）：1017

［7］ Shen J，Yang S，Yu H，et al.Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory（沈静，阳胜，于红，等.光谱实验室），2011，28（1）：235

［8］ Zhao H X.Food Engineering（赵海霞.食品工程），2012（4）：47

［9］ Tian X Y，Yi J G，Xu S J，et al.Endemic Diseases Bulletin（田秀芸，易建国，徐世江，等.地方病通报），2003，18（4）：91

［10］ Shi Q Y.Modern Food Science and Technology（施琦贻.现代食品科技），2012，28（5）：598

［11］ Yao J，He X W，Li X X，et al.Science and Technology of Food Industry（姚军，何晓文，李新霞，等.食品工业科技），（2013－05－02）［2014－01－20］.http：／www.cnki.net／kcms／detail／11.1759.TS.20130502.1348.010.html

［12］ Nomeir A A，Abou－Donia M B.J Am Oil Chem Soc，1982，59：546

［13］ Wu W W，Xu G R.Journal of Agricultural University of Hebei（吴伟伟，许赣荣.河北农业大学学报），2009，32（5）：106

［14］ Shen Y，Xue Y L，Jin Q Z，et al.China Oils and Fats（沈媛，薛雅琳，金青哲，等.中国油脂），2012，37（10）：71

［15］ Ma Y J，Shi G Y，Chen B.Journal of Hygiene Research（马勇健，石根勇，陈蓓.卫生研究），1993，22（5）：302

［16］ Xiang P，Shen M，Zhuo X Y.Journal of Instrumental Analysis（向平，沈敏，卓先义.分析测试学报），2009，28（6）：753

［17］ Perello A E，Moreno M V，Monaco C，et al.Biocontrol，2009，54（1）：113