超快速液相色谱－四极杆／线性离子阱质谱同时检测猪组织中9种β－受体阻断剂残留

张鸿伟， 许 辉， 高建国， 梁成珠， 徐 彪，耿 娟， 王凤美， 张晓梅， 程 刚

（1.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东 青岛266002；2.青岛出入境检验检疫局，山东 青岛266001）

β－受体阻断剂（β－blockers，BBs）是一类能选择性地与β－肾上腺素受体结合，从而拮抗神经递质和儿茶酚胺对β－受体激动作用的药物，是临床上防治心律失常、心绞痛、高血压、心动过速、甲状腺毒症、肥厚性主动脉狭窄以及心脏梗死的首选治疗剂［1，2］。由于该类药物具有一定的镇静作用，能提高某些运动项目的成绩，常被非法使用于体育赛事而被世界反兴奋剂组织（WADA）所禁用［3］。BBs在畜牧养殖业中也常被非法用作镇静剂，一方面通过降低动物的运动量来促进饲料转化率；另一方面还可缓解应激反应以降低动物在运输、交配、分娩等压力下的发病率和死亡率以及避免对肉质的不良影响［4，5］。BBs常通过肌肉注射和静脉注射方式给药，且往往在动物屠宰或运输前数小时使用，导致其在可食动物组织中残留风险较高，对人体造成的健康风险更大。目前，国际上一些地区和组织已对BBs类药物卡拉洛尔（carazolol）在动物组织中的残留限量做出了明确要求［6，7］（欧盟和国际食品法典委员会规定猪肌肉中残留限量为5μg／kg，猪肝、肾为25 μg／kg）。我国当前既未批准BBs可作为兽药使用，也未明确相关限量要求。经济利益的驱动使得BBs在畜牧养殖加工业中存在违法使用的风险，因此建立快速、准确、灵敏的检测方法尤为必要。

关于食源性动物组织中BBs残留分析的报道相对较少，现有文献多采用液相色谱－串联质谱（LCMS／MS）进行检测。由于动物源基质的复杂性，BBs残留分析前处理过程多涉及液－液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）净化等过程，处理通量较低［8，9］。而快速分析［10］则因通量因素导致净化程度不够，方法定量限水平较高（～20μg／kg）。随着Anastassiades等［11］基于QuEChERS方法使用N－丙基乙二胺（PSA）进行分散固相萃取（dispersive solid－phase extraction，d－SPE）净化，d－SPE技术以其简单快速、效果明显的特点在生物样品药物残留分析中应用逐渐广泛［12－14］。近年来超高效／快速液相色谱（UPLC／UFLC）和亚2μm色谱柱技术的发展成熟给分析领域带来了新的变化，高通量超快速分析已成为残留分析的发展趋势［15］；另外，杂交型串联质谱仪，如四极杆／线性离子阱串联质谱仪（Q／Trap MS）因兼具四极杆与离子阱双重功能，可快速完成检测和确证的相关报道也逐年增多［16－18］。本文综合应用d－SPE净化、超快速色谱分离、杂交质谱仪高级质谱采集模式等手段建立了猪组织中9种BBs（阿替洛尔、吲哚洛尔、醋丁洛尔、美托洛尔、卡拉洛尔、拉贝洛尔、比索洛尔、普萘洛尔和喷布洛尔）残留的快速检测技术。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1290 Infinity超快速液相色谱仪（美国Agilent公司）；5500 Q／Trap四极杆／线性离子阱质谱仪（美国AB Sciex公司），配有电喷雾离子源（ESI），应用软件为Analyst（1.5.2版本）；CR22GⅡ高速冷冻离心机（日本 Hitachi公司）；Caliper TurboVap®LV高通量水浴氮吹浓缩仪（美国Caliper公司）；SHAB水浴恒温振荡器（中国国华公司）。

甲醇、乙腈（LC－MS级，美国 Merck公司），β－葡糖苷酸／硫酸酯酶、乙酸、甲酸及甲酸铵（分析纯，美国Sigma－Aldrich公司）；乙酸铵、氯化钠、Na2EDTA、氢氧化钠均为国产分析纯试剂；水为Milli－Q Advantage A10系统制备的超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。

乙酸铵缓冲液：15.4 g乙酸铵用水溶解并定容至1 L，用乙酸调pH值为5.2。提取溶液：将37.5 g Na2EDTA溶于乙酸铵缓冲液中并定容至1 L。

BBs标准品：阿替洛尔（atenolol，纯度99.0%）、美托洛尔（metoprolol tartrate，纯度99.5%）、卡拉洛尔（carazolol，纯度99.0%）和比索洛尔（bisoprolol fumarate，纯度99.0%）（德国 Dr.Ehrenstorfer公司）；吲哚洛尔（pindolol，纯度98.0%）和拉贝洛尔（labetalol hydrochloride，纯度98.0%）（加拿大 Toronto Research Chemicals公司）；醋丁洛尔（acebutolol hydrochloride，纯度100%）和普萘洛尔（propranolol hydrochloride，纯 度 100%）（美 国 Sigma－Aldrich公司）；喷布洛尔（penbutolol sulfate，纯度99.0%）（欧洲药品质量和卫生保健理事会（EDQM））；BBs氘代同位素内标：atenolol－d7（纯度98.0%）、pindolol－d7（纯 度 97.0%）、acebutolol－d5（纯度98.0%）、metoprolol－d7（纯度98.0%）、bisoprolol－d5（纯 度 98.0%）和 penbutolol－d9 hydrochloride（纯 度99.6%）（加拿大 Toronto Research Chemicals公司）；carazolol－d7（纯度99.5%）（德国 Dr.Ehrenstorfer公司）；propranolol－d7（纯 度 99.0%）（加 拿 大 C／D／N Isotopes公司）。

BBs标准溶液：除比索洛尔外，分别取其他BBs标准品10.0 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成1.0 g／L的标准储备液，于－20℃保存；比索洛尔标准品为0.01 g／L 的乙腈＋0.5%H3PO4水溶液（1∶1，v／v），可直接作为储备液使用，于（20±4）℃保存。称取各氘代内标5.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成0.1 g／L 的内标储备液，于－20℃保存；实验中用0.2%（v／v）甲酸水溶液稀释上述标准储备液，配制成不同浓度的混合标准工作液。现用现配。

d－SPE净化管（BondElut，15 mL，High Pigment）购自美国Agilent公司；硅藻土为国产分析纯材料；实验中所用猪肉、猪肝和猪肾样品均为市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex®KinetexTMC18－XB（150 mm×2.1 mm，2.6μm）；柱温：30 ℃；流速：0.25 mL／min；进样量：3μL；流动相：A为甲醇，B为水（含0.1%（v／v）甲酸）；梯度洗脱程序：0～5 min，5%A～70%A；5～6 min，70%A～100%A；6～7 min，100%A；7～7.1 min，100%A～5%A；7.1～10 min，5%A。

1.2.2 质谱条件

离子化方式：ESI＋；采集模式：预设定多反应监测－信息依赖性采集－增强子离子扫描（sMRM－IDAEPI）；sMRM参数：检测窗口45 s，目标扫描时间1 s；IDA参数：采集阈值 3 000 cps（勾选动态背景扣除）；EPI参数：扫描速率 10 000 Da／s，扫描质量数范围m／z 50～400，碰撞能量35 eV，扩展碰撞能量15 eV，离子阱时间选动态填充；离子源参数：离子源温度500℃，雾化气（氮气）压力0.276 MPa，气帘气（氮气）压力0.241 MPa，辅助气（压缩空气）压力0.344 MPa，电喷雾电压5 500 V；化合物参数：BBs各化合物及其内标母离子、子离子的碰撞能量、多反应监测离子对见表1。

表1 BBs类药物及其内标sMRM模式下的质谱参数Table 1 MS parameters for BBs and their internal standards in sMRM mode

1.3 样品前处理

称取2.0 g均质后组织试样，置于50 mL离心管中，加入混合内标溶液40μL（相当于试样中含量2μg／kg），于暗处静置15 min后加入β－葡糖苷酸／硫酸酯酶液40μL和提取溶液5 mL，涡旋1 min，50℃水浴中振荡水解1 h，取出冷却至室温，用2 mol／L NaOH溶液调节其pH至10.0。

在提取液中加入25 mL乙腈、2 g硅藻土和2 g NaCl，涡旋后振荡10 min，在0 ℃、10 000 r／min下离心10 min；取10 mL上清液加入d－SPE净化管中，涡旋后振荡5 min，在0℃、10 000 r／min 下离心5 min；取5 mL上清液于40℃下氮吹至近干，用0.5 mL甲醇超声溶解后转移至2 mL Eppendorf管中，在0℃、15 000 r／min下离心10 min，取上清液于40℃下氮气吹干，准确加入1 mL甲醇－水（含0.2%（v／v）甲酸）（1∶9，v／v）复溶残渣，过0.22μm滤膜后测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择与优化

BBs类药物通常含有R－O－CH2－CH（OH）－CH2－NH－CH（CH3）2结构，在ESI＋条件下易形成质谱特征碎片离子 m／z 116［（N－异丙基－N－2－羟丙基胺）＋H］＋（见表1）；此外，常见的中性丢失有氨基、水、烯烃基等，碎片离子信息丰富［19］。在质谱方法建立时，尽可能采集更多的碎片离子用于方法的筛选，对于改善方法的性能指标如测定低限、准确度和精密度等有积极意义。以喷布洛尔为例，图1显示了其6个不同碎片离子组成的sMRM扫描标准溶液、肾脏基质空白和加标肾脏基质空白的质量色谱图。由图1可见，6个sMRM谱图中m／z 292.2／74.0显示出较强的基质干扰，导致选择性差；m／z 292.2与113.1、168.1、56.0组成离子对的sMRM谱图信噪比较差；故优选出选择性强、信噪比优的 m／z 292.2／236.2与 m／z 292.2／201.2进行定量和定性。本文针对9种BBs及8种同位素内标共预选了91对sMRM离子进行筛选，优选后的sMRM离子见表1。

欧盟2002／EC／657委员会决议［20］规定了质谱确证分析的相关要求，包括确证点的要求、离子比率和保留时间的容许范围等。但在实际分析中，有时采用上述确证规则时会出现困扰。如Kaufmann等［21］发现对于单电荷离子存在多质子位点的化合物（如双氟沙星等）采用欧盟确证规则会导致结果误判。Dahane等［18］也认为在离子对响应差别较大（10倍以上）时采用欧盟规则进行低浓度水平确证分析存在困难。本文中喷布洛尔优选的两个离子对响应差别在6倍以上（见图1），在低浓度水平时由于定性离子绝对响应较低，定量时容易导致离子比率接近容许限而出现结果判定困难。Q／Trap型质谱仪可在线实时获取目标物的全扫描碎片图谱，可作为确证分析的有效辅助判据［16－18］而改善判定困境。本文BBs在线质谱数据库的构建采用sMRMIDA－EPI模式，质谱参数设定见1.2.2节，BBs混合标准溶液（2μg／L）在优化的色谱条件（见1.2.1节）下分析，采集各目标物的EPI谱图，同时采用空白组织（肝脏、肾脏和肌肉）基质制备BBs基质标准溶液（2μg／L），在相同条件下分析，采集相应的EPI谱图，并与标准溶液采集的EPI谱图进行在线比对。匹配分析使用 Analyst 1.5.2（AB SCIEX）软件进行，结果显示各目标物的EPI谱图匹配纯度（purity）值均大于95（完全匹配值为100），提示可使用标准溶液建立的EPI谱库对测定样品进行匹配分析。9种BBs混合标准溶液（2μg／L）按本文的色谱－质谱条件在线采集的EPI谱图和选择离子流图见图2。

2.2 色谱条件的选择与优化

9种BBs类药物均为碱性化合物（p Ka≈9.5），其log P值范围为0.34～4.02（使用欧洲生物信息研究所在线数据库ACD软件预测），显示其极性范围较宽。为了实现宽极性范围碱性目标物的超快速色谱分析，除采用超快速色谱硬件系统外，色谱柱与流动相的选择也是关键。

近年来，一些采用了新的填料类型或新型固定相结构的色谱柱在超快速分析中有更好的应用优势［22］，其中核－壳型色谱柱在碱性物质和宽极性范围多残留分析中有较好表现［16，23］。本文先后考察了5种不同类型、品牌和规格的C18色谱柱，分别为柱1（Shiseido Capcell MG III C18，150 mm×3.0 mm，5μm）、柱 2（Chromex Scientific Sunshell C18，150 mm×2.1 mm，2.6μm）、柱3（Merck Chromolith Performance C18e，100 mm ×2.1 mm）、柱4（Phenomenex Gemini－NX C18，150 mm×4.6 mm，3μm）和柱5（Phenomenex Kinetex C18－XB，150 mm×2.1 mm，2.6μm）。其中柱1适用于在酸性条件下分离碱性物质；柱2和柱5均为核－壳型色谱柱，传质效率高，适合快速分析；柱3为整体柱，背压极低，适合超高流速分析；柱4为B型硅胶固定相，可在高pH下进行碱性化合物分析。在流动相选择上，碱性化合物分析通常多采用酸性流动相以减免硅醇残基对离子化目标物的吸附作用而出现峰形不对称、分辨率低或保留不重现等现象；或是采用碱性流动相选用耐碱色谱柱进行分析。因此，本文以水－甲醇／乙腈分别组合作为流动相，再选用氨水、甲酸、乙酸及其铵盐为流动相修饰剂并调节洗脱梯度，选用适当的流动相体系，观察不同条件下BBs混合标准溶液中目标物的分离度、色谱峰形、灵敏度及分析通量。结果显示：这5种色谱柱均能在可接受的分离度下完成对9种BBs的超快速分析（单次分析循环不超过10 min），在4种适用酸性流动相体系的色谱柱中，柱5（Phenomenex Kinetex C18－XB）在灵敏度、色谱峰形和分离度上表现最优，而柱1灵敏度较低，柱2和柱3灵敏度低且有峰拖尾现象；柱4使用碱性流动相体系（pH10.0）进行分析，在灵敏度、色谱峰形和分离度方面均与柱5相当，然而其优化的流速为0.8 mL／min，而柱5的优化流速为0.25 mL／min，在流动相和用气量消耗方面柱5更为优秀，故最终选择核－壳型色谱柱（Phenomenex Kinetex C18－XB）为本文分析用柱。在流动相的选择上，甲醇－水体系在10 min内可实现7种BBs的基线分离且在0.1%（v／v）甲酸的酸度下就能实现灵敏度和色谱峰形的优化，而乙腈－水体系仅能实现6种BBs的基线分离且需在0.3%（v／v）甲酸下才能有较好的分离效果，故最终选择流动相为甲醇与水（含0.1%（v／v）甲酸）并在1.2.1节的梯度条件下洗脱。9种BBs在优化的色谱条件下的色谱图见图2中的XIC of sMRM图。

图1 （a）喷布洛尔标准溶液（2μg／L）、（b）肾脏空白基质和（c）添加喷布洛尔（2μg／L）的肾脏空白基质的sMRM 图谱Fig.1 sMRM spectra of（a）standard solution of penbutolol（2μg／L），（b）blank kidney matrix and（c）the blank kidney matrix spiked with penbutolol at 2μg／L

图2 9种BBs混合标准溶液（2μg／L）在线EPI谱图及选择离子流图Fig.2 On－line EPI spectra and XIC chromatogram of the nine BBs acquired with composite standard solution（2μg／L）

2.3 前处理条件的优化

BBs类部分药物（通常为含有酚基结构的药物如拉贝洛尔和卡拉洛尔）易在生物体内形成葡糖醛酸轭合物或硫酸轭合物［5，24］。本文选用快速酶解方法［25，26］保证了处理通量并解离了可能的结合态残留药物，接近中性（pH5.2）的酶解环境能显著减少基质共萃取物［27］，缓冲液中加入EDTA可减免强极性目标物与金属阳离子形成复合物而影响提取效率［2，28］。提取溶剂选择乙腈是因其较甲醇有更好的蛋白沉淀作用、共萃取作用弱且可以盐析分层，实验显示其提取液较为清澈，基质效应弱。BBs在水溶液中呈碱性，酶解完成后碱化水相和盐析有利于目标物去电荷而向有机相分配，提升提取效率［2，29］。实验分别调节pH值为9.5、10.0和11.0，结果显示pH值为10.0时各目标物的提取效率最优，这与文献［30］的报道一致，故选择调节pH为10.0。

基于QuEChERS方法的d－SPE技术可有效提高前处理通量。本文分别考察了硅藻土、C18填料以及QuEChERS方法组合净化剂（MgSO4＋PSA＋C18）的d－SPE效果。结果显示：在3种基质中，硅藻土和组合净化剂的使用效果相当且均优于C18填料，并以在肌肉基质中的使用效果最优。基于实验成本考虑，选用硅藻土为净化吸附剂。然而对于肝、肾基质，仅采用一次d－SPE处理提取液，发现有明显的色素存在，对低浓度水平（如0.5μg／kg）的分析有较强的影响。为了减弱基质干扰，本文采用BondElut组合净化填料（150 mg PSA＋45 mg石墨化炭黑（GCB）＋855 mg MgSO4）进行二次d－SPE净化（GCB和PSA均可吸附亲脂性色素），并采用甲醇复溶进一步去除磷脂类干扰物以防止溶剂转换导致的分析物损失［9，17］，再辅以高速冷冻离心，结果显示：肝、肾基质的提取液明显清澈，基质干扰现象减弱；肌肉基质经过二次净化后，基质影响更为减弱。图3显示了3种猪组织空白基质与加标（0.5 μg／kg）空白基质的总离子流图。

由图3可见，在添加水平为0.5μg／kg时，3种猪组织中各目标物在保留时间窗口内无明显干扰。另外，方法中各BBs的绝对回收率范围为52.4%～76.2%，显示本文离子对优化选择的有效性及前处理方法设计的合理性。此外，本文8种BBs同位素内标的sMRM离子（见表1）在其保留时间窗口内亦无明显干扰（数据略）。同时，依据前处理绝对回收率计算结果，拉贝洛尔以吲哚洛尔氘代内标为内标（两者绝对回收率最为接近）进行标准曲线制作及定量计算。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系和定量限

图3 （a）加标（0.5μg／kg）猪空白组织和（b）猪空白组织的sMRM总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of（a）blank porcine tissues spiked with BBs at 0.5μg／kg and （b）blank porcine tissues

使用甲醇－水（含0.2%（v／v）甲酸）（1∶9，v／v）溶液配制质量浓度分别为0.10、0.20、0.50、1.0、5.0、10、20μg／L（同位素内标质量浓度均为 0.8 μg／L）的系列浓度标准溶液，在选定的色谱－质谱条件下测定，内标法定量，线性回归采用1／x权重（校正低浓度端准确度），在满足准确度在80%～120%的基础上计算相关系数（r），9种BBs的线性关系见表2。由表2可见，BBs由于其质谱响应较高，其线性范围有所收窄，换算成样品中含量范围为0.25～50μg／kg，表明方法在低浓度水平有更好的定量精度，有利于BBs滥用的控制。

本文以在空白组织基质中添加BBs，将定量离子对的信噪比≥10定义定量限，参照目前国际上对卡拉洛尔的限量要求及以提高风险监测水平为目的，基质空白添加水平选取为0.5μg／kg，计算各目标物在此水平上的信噪比。结果显示9种BBs在0.5μg／kg 添加水平时，3种猪组织基质中各目标物定量离子对的S／N≥15，说明采用本方法各目标物定量限均可达到0.5μg／kg。

表2 混合标准溶液中9种BBs的线性关系Table 2 Linear relationships of the nine BBs in a mixed standard solution

2.4.2 方法的回收率和精密度

本文分别选用空白猪肝、猪肾和猪肉基质，参照《进出口食品安全风险监控实验室质量控制指南［2011］398号》的规定，添加0.5、1.0和5.0μg／kg进行回收率测定，每个水平6个试样，计算回收率与RSD，结果见表3。在3个添加水平下BBs的平均回收率为87.5%～111.8%，RSD≤12.5%，显示本方法对猪组织BBs残留测定有很好的适用性和可重复性。

2.4.3 方法的基质效应

为了控制基质效应，本文采取的措施有：①采用选择性更好的sMRM。②采用了多重净化措施。③采用同位素内标补偿基质效应影响。选用了8种BBs同位素内标并优化了监测离子对（见表1），对没有同位素内标的拉贝洛尔通过绝对回收率考察选择了合适的替代内标，其定量结果显示在3个添加水平上回收率为89.4%～106.1%，RSD≤12.5%，显示了替代内标选择的合理性。④稀释提取液。通过缩减提取液体积降低引入基质组分的绝对量。⑤降低进样量。将进样量降低至3μL，减少基质负载。通过上述措施，本文建立的方法有效地控制了猪组织中BBs残留分析的基质效应影响（见图3），定量结果满足残留分析要求（见表3）。

表3 猪组织中9种BBs的加标回收率及精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations for the nine BBs spiked in blank porcine tissues（n＝6）

2.4.4 方法EPI谱图谱库比对纯度阈值的确定

本文使用在线EPI谱图谱库比对进行BBs快速辅助确证。研究对定量限（0.5μg／kg）水平各组织基质中BBs的绝对响应进行评估，确定IDA扫描触发阈值水平为3 000 cps，以标准溶液的EPI在线谱库为参照库（见图2），参照文献［16］的方法确定谱库比对纯度阈值为80。测试中样品BBs的在线EPI谱图匹配纯度值超过80即可作为辅助确证分析的有效判据。

2.5 实际样品检测

使用本文建立的方法对从青岛一农贸市场不同摊位采集的20份猪相关组织样品进行BBs残留测定分析，该批次测定样品中未发现有相关BBs残留。尽管此次采样没有监测到相关物质残留，但是对覆盖不同地域不同来源的更广泛的样品进行BBs残留监测，对于食品安全风险监控体系的完善有重要的实践意义。

3 结论

本文使用超快速液相色谱－四极杆／离子阱质谱建立了猪组织中9种BBs残留测定的分析方法。该研究进行了监测离子对的筛选优化，并采用双重d－SPE等净化手段有效控制了复杂动物源样品的基质效应，降低了方法的定量限，质谱分析采用sMRM－IDA－EPI高级采集模式，在线EPI谱库辅助确证分析，提高了检测效能和确证可靠性。该方法快速简便、灵敏度高、重现性好、适用性强，定量限满足国内外相关法规要求，可有效用于BBs残留监控监测和实验室日常分析。

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