九香虫的石油醚及甲醇粗提物对SGC7901细胞增殖和细胞周期的影响

刘川燕，张 莉，侯晓晖，昌 艺，孙志诚

(遵义医学院，贵州遵义563099)

九香虫属半翅目蝽科，是重要的药用昆虫。现代医学证实，九香虫具有抗炎、抗菌、抗癌、促纤溶、解痉、镇痛及恢复机体免疫功能等多种作用［1］。我们前期研究［2，3］用氯仿和乙醇粗提九香虫有效成分进行肿瘤细胞的体外实验，发现九香虫粗提物虽能抑制肿瘤细胞体外增殖，但并非通过影响细胞周期而产生作用。在上述基础上，2011年11月～2012年4月，我们以石油醚和甲醇为试剂，提取九香虫体内的有效成分，对其抗癌作用机制进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞株SGC7901，由遵义医学院中心实验室惠赠;九香虫样品购自遵义百颐医药有限责任公司，研成粉末备用;胎牛血清;PBS;胰蛋白酶;青霉素;链霉素;RPMI Medium DMEM培养基;MTT粉末;DMSO;C1052细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 九香虫粗提物的制备 取九香虫粉末11 g，分别以石油醚和甲醇为溶剂、索氏提取器连续回流提取法提取九香虫有效成分，分别收集提取液(九香虫粗提物)，待自然挥干，－20℃保存备用。

1.2.2 细胞培养与传代 将胃癌细胞SGC7901置5%CO2培养箱(37℃)中，10%胎牛血清DMEM培养基培养。细胞呈单层生长并铺满平底时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.3 细胞分组及干预 取已传代的细胞，设石油醚组、甲醇组、阴性对照组和空白对照组，每组6个复孔。石油醚组分别加入浓度为35、52、79、118、178、267、400 μg/mL 的石油醚粗提物，甲醇组分别加入浓度为 70、105、158、237、355、533、800 μg/mL的甲醇粗提物，均按1.5倍稀释;阴性对照组加入含有石油醚或甲醇的培养基;空白对照组中仅加入培养基。

1.2.4 检测项目

1.2.4.1 SGC7901细胞形态变化 给药48 h后，倒置显微镜下观察各组SGC7901细胞形态的变化。

1.2.4.2 SGC7901细胞增殖抑制率 取对数生长期的细胞，以每孔1×104个细胞接种于96孔板中［4］。给药48 h后采用MTT法，检测490 nm波长下的吸光度(A)值，重复3次取均值。计算细胞增殖抑制率［增殖抑制率=(1－给药孔A值/对照孔A值)×100%］及IC50［4，5］。

1.2.4.3 SGC7901细胞周期变化 石油醚中剂量组及高剂量组分别采用浓度为1/2 IC50及IC50的石油醚粗提物干预;甲醇中剂量组及高剂量组分别采用1/2 IC50、IC50浓度的甲醇粗提物干预。空白对照组不干预。培养48 h后收集细胞，PBS洗涤、70%乙醇固定;避光条件下加入染色液200 μL，吹打均匀;避光预热30 min后，4℃放置备用。流式细胞仪检测细胞周期，结果用CELL Quest软件分析，统计各组S期、G2～M期、G0～G1期的细胞比例。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，计量资料数据以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SGC7901细胞形态变化 空白对照组细胞呈梭形，细胞贴壁、透明度较大、胞膜清晰，生长旺盛。阴性对照组细胞未发生改变。石油醚组及甲醇组则表现为细胞变圆、皱缩，细胞间空隙加大，染色质固缩、胞质内出现颗粒状异物，形成较多的细胞碎片。见图1。

图1 九香虫的石油醚及甲醇粗提物对SGC7901细胞形态的影响(200×)

2.2 SGC7901细胞增殖抑制率 石油醚组和甲醇组细胞增殖抑制率均低于空白对照组(P均＜0.05)，且呈剂量依赖性，见表1。石油醚和甲醇的IC50分别为 52.3 μg/mL 及 168.8 μg/mL。

2.3 SGC7901细胞周期变化 与空白对照组相比，石油醚组和甲醇粗提物干预后S期及G2～M细胞比例增加，G0～G1期细胞比例降低(P＜0.05)，甲醇组的效果优于石油醚组。见表2。

表1 不同浓度石油醚和甲醇粗提物对SGC7901细胞增殖抑制率的影响(±s)

表1 不同浓度石油醚和甲醇粗提物对SGC7901细胞增殖抑制率的影响(±s)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05

组别 细胞增殖抑制率(%)石油醚组35 μg/mL 11.22 ±0.14*52 μg/mL 53.79 ±0.09*79 μg/mL 86.35 ±0.01*118 μg/mL 88.03 ±0.01*178 μg/mL 89.35 ±0.01*267 μg/mL 90.92 ±0.01*400 μg/mL 91.05 ±0.00*甲醇组70 μg/mL 16.84 ±0.05*105 μg/mL 23.85 ±0.07*158 μg/mL 42.71 ±0.05*237 μg/mL 80.56 ±0.06*355 μg/mL 83.51 ±0.02*533 μg/mL 86.10 ±0.00*800 μg/mL 87.40 ±0.01*

表2 各组SGC7901细胞周期变化(%，±s)

表2 各组SGC7901细胞周期变化(%，±s)

注:与空白对照组相比，*P＜0.05

*石油醚高剂量组 58.85 ±8.01 34.63 ±5.12* 6.51 ±2.89石油醚中剂量组 55.28 ±4.02 34.61 ±3.68* 10.12 ±1.94甲醇高剂量组 42.12 ±0.28*40.59 ±0.99* 17.29 ±0.74*甲醇中剂量组 57.67 ±1.81*33.88 ±0.77* 8.46 ±1.05*空白对照组61.45 ±5.40 29.37 ±1.76 9.19 ±3.91

3 讨论

九香虫粗提物的成分具有抗肿瘤作用［6～9］。以往多采用浸提法提取九香虫的有效成分。本研究中采用连续回流提取法，其优点为操作简便、节省试剂，缺点是时间耗时较长、对受热易分解的成分不宜采用［10］。理论上，温度过高会导致九香虫体内的物质被破坏，从而对实验结果造成影响。

本研究中两种方式获得的九香虫粗提物对SGC7901细胞体外增殖均有明显的抑制作用，提示采用该方法进行抗癌有效成分提取是可行的，但是否有其他抗癌有效成分被破坏还有待进一步深入研究。

石油醚和甲醇均为天然产物提取的常用试剂，与我们前期研究中采用的氯仿和乙醇相比，两者分别具有亲脂性强和穿透力强的优点［10］。九香虫氯仿和乙醇粗提物对SGC7901细胞体外增殖的的IC50分别为 1 281.62 μg/mL 和 1 193.52 μg/mL［2，3］。本研究发现，石油醚和甲醇粗提物的 IC50为52.3 μg/mL 和168.8 μg/mL，有效浓度大大降低，抑制作用提高，说明两者作为试剂进行抗癌有效成分提取是高效的。本研究结果显示，九香虫的石油醚和甲醇粗提物均可抑制SGC7901细胞的体外增殖，但前者显著优于后者，提示石油醚提取的粗提物中抗癌有效成分量和(或)作用高于甲醇。另外，细胞周期检测结果证实，两种粗提物对细胞增殖的抑制是由于其细胞周期的阻滞作用，使得SGC7901细胞停滞于S

期，S期作为DNA合成、染色质组装和中心粒复制的主要时期［11～13］，其明显改变会影响细胞增殖。与我们前期研究［2，3］(氯仿和乙醇)结果相比，石油醚和甲醇粗提物对SGC7901细胞增殖及细胞周期的影响更显著。

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