2株纤维素降解细菌处理白酒丢糟的应用特性

游玲，周黎军，罗刚，陈思慧，王涛

（1.生物技术与产业研究院，四川宜宾644007；2.宜宾职业技术学院，四川宜宾644007；3.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644007）

白酒丢糟是白酒酿造的主要副产物，每生产1 t白酒就可产生2.5 t丢糟[1]，丢糟含水量高，酸度大，不易保存，易腐败变质，污染环境，同时含有部分淀粉（10%左右）、粗纤维（20%左右）、粗蛋白（7%～9%）、氨基酸、有机酸、低碳糖、杂醇等丰富的有机成分，是一种传统的辅助饲料，一个年产万吨的白酒厂可生产丢糟饲料7 000 t[2]。同时随着丢糟产量的增加和工业上对饲料质量要求的提高，鲜丢糟直接用于饲料的做法已不现实，如果采用能有效降解丟糟纤维素、能大量繁殖且蛋白质可利用率高的菌株，对丢糟进行再发酵，转化丟糟为高蛋白饲料，可在不增加投入的情况下，大大提高丢糟的利用效率。

目前国内主要用于生产菌体蛋白的微生物有曲霉菌、根霉菌、假丝酵母菌、乳酸杆菌、乳酸链球菌、枯草杆菌、赖氨酸产生菌、拟内孢霉、白地霉等[3-4]。但这些菌株通常在白酒丢糟中生长不良，在前期研究中，本课题组对分离自530株细菌分解纤维素的能力测试，发现宜宾浓香型白酒产区广泛分布的芽孢杆菌属细菌有很好的分解纤维素能力[5]。本研究拟对筛选到的2株对纤维素分解力最强的细菌进行应用研究，探索在较粗放条件下细菌发酵生产丢糟饲料的可行性及可控的工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

白酒丢糟：宜宾叙府酒业公司提供。

保存于发酵资源与应用四川省高校重点实验室的2株分解纤维素能力较强的两株细菌，分别编号S522B-41、G7B-58，经 16S rDNA特征序列分析，S522B-41菌株被初步鉴定为Bacillus safensis，G7B-58菌株被鉴定为Bacillus cereus。

1.2 菌种活化及耐受性测试

菌株接种于NA液体培养基（灭菌后添加无菌的HCl调节pH至4.0）中，40℃、90 r/min培养。每3小时测量培养液OD值（440 nm），绘制生长曲线。

1.3 菌株降解纤维素能力测试

2株菌的NA培养基菌悬液用无菌水调节至大致一致（OD440nm0.5左右）后，分别将 S522B-41、G7B-58及2株菌等比例混合后的菌悬液各200 mL添加到无菌塑料袋盛装的5 kg丢糟中，封闭袋口，室温（25℃～28 ℃）自然发酵，分别在第 0、2、4、6、8 天测丢糟纤维素、蛋白质、水分、淀粉、还原糖及酸度，以未接种菌悬液的丢糟为空白对照。

按照同样的接种方式，分别接种100、200、400 mL菌悬液于10 kg丢糟中，室温下覆膜堆积处理8 d，在第 0、2、4、6、8 天测试丢糟纤维素含量。

1.4 分析检测方法

纤维素及蛋白质含量分别参考文献[6-7]进行。水分、酸度、残淀和残糖检测按参考文献[8]进行。

2 结果分析

2.1 纤维素分解细菌对丢糟环境的适应性

2株细菌在丢糟中的生长情况见图1。

图1 S522B-41、G7B-58菌株的生长情况（40℃，pH 4.0）Fig.1 Growth of S522B-41 and G7B-58 in the medium of pH 4.0 under 40℃

接种丢糟0～6 h内2株菌均有明显的生长停滞现象，但整个生长过程呈现出波动上升的趋势，到24 h时其上升趋势已非常明显，表明高温高酸的环境条件对2株菌生长有一定影响，但两株菌经短暂适应期后均可在丢糟内正常生长繁殖，可用于白酒丢糟处理。

2.2 菌株组合筛选

菌株组合筛选如图2所示。

图2 G7B-58、S522B-41对丢糟纤维素的降解（4%接种量）Fig.2 Cellulose-degradation of waste distiller's grains inoculated with 4%suspension of G7B-58 and（or）S522B-41

与空白相比，纤维素分解细菌G7B-58、S522B-41可明显降低丢糟纤维素含量，分别处理丢糟8 d后可使丢糟纤维素含量由26.84%降低到22.31%及22.39%，其降解率分别达到16.9%及16.6%，两株菌混合处理丢糟后丢糟纤维素含量可降低至21.02%，降低了21.7%，体现了一定的加合作用，且该加合作用在延长处理时间（6 d以上）时尤为明显，考虑到生产实践中，长时间堆积将会影响到场地使用效率，而且混菌处理较单菌株处理复杂，可控性也较差，因此，单菌株更适宜丢糟短时处理。

如图3所示，G7B-58、S522B-41可显著提高丢糟蛋白含量，两株菌分别处理丢糟8 d后可使丢糟蛋白质含量从8.96%提高到为12.10%及12.47%，提高了35.0%及39.2%，两株菌混合处理丢糟可使丢糟蛋白含量达到12.64%，提高了41.1%，可见这两株细菌可明显促进丢糟蛋白质含量的增加。总体上，S522B-41菌株产蛋白的能力明显好于G7B-58菌株，但两株菌降解纤维素的能力相差不大，说明S522B-41菌株可能除利用纤维素外，还可能可以利用丢糟中的其他碳源积累菌体蛋白，如少量淀粉、残糖甚至有机酸等，其对丢糟物质的转化效果总体上G7B-58菌株，两株菌混合处理在积累菌体蛋白，增大丢糟蛋白质含量方面也不存在明显加合作用，结合考虑工艺复杂性等因素，利用单菌株处理丢糟比混菌处理更为可行。

图3 G7B-58、S522B-41对丢糟蛋白质含量的影响（4%接种量）Fig.3 Protein content of waste distiller's grains inoculated with 4%suspension of G7B-58 and（or）S522B-41

2.3 接种量对丢糟处理效果的影响

接种量对处理效果的影响见表1。

表1 不同接种量对丢糟成分变化的影响Table 1 Components of waste distiller's grains inoculated with different inoculum of G7B-58 or S522B-41

增大接种量意味着起始时接入更多菌体，理论上可缩短菌体细胞在丢糟环境中的适应期，但菌悬液带入的水分也会增加工艺难度。从表1可以看出，接种量对丢糟水分变化、纤维素降解率、蛋白质增量影响不大，对淀粉及还原糖的含量变化有明显影响，对丢糟酸度变化有显著影响。

处理8 d后，接种1%的S522B-41菌悬液可增大丢糟酸度，接种2%的S522B-41菌悬液时丢糟酸度降低最为明显，达81.6%，同时菌株对丢糟中的淀粉、残糖、纤维素的消耗明显增加，其蛋白含量也增加最多，但进一步增大接种量到4%，其降酸及利用纤维素的效果反而较差，可能是由于接种量过大导致菌体在相对贫瘠的丢糟营养环境中由于相互竞争生长不良。

对G7B-58菌株来说，也有类似现象，2%及4%的接种量下，该菌株降解丢糟纤维素及积累蛋白的效果差异不大，但2%接种量下，菌株降低丢糟酸度，利用淀粉或残糖的效果更好。因此，我们认为两株菌处理丢糟的接种量均以2%（菌悬液浓度控制在OD440nm=0.5～0.6）为宜。

2.4 处理时间对丢糟处理效果的影响

两株细菌的菌悬液按2%接种量接入10 kg丢糟后，2 d内菌体即大量增殖，体现为丢糟蛋白含量上升最快，4 d后其含量渐趋于稳定（图3），同时丢糟纤维素含量持续下降。悬液接种丢糟后，2 d～3 d内即可完成菌体增殖，表明菌体增殖所需碳源并非来自丢糟纤维素的降解，也就是说丢糟纤维素降解与丢糟蛋白积累之间不存在明显的因果关系，菌体生长不仅导致丢糟中纤维素、蛋白质含量下降，对丢糟中其余组分也有一定影响（图4～图7）。

图4 细菌处理丢糟后丢糟水分含量变化趋势Fig.4 Moisture trend of waste distiller's grains inoculated with G7B-58 or S522B-41

图5 细菌处理丢糟后丢糟酸度变化趋势Fig.5 Acidity trend of waste distiller's grains inoculated with G7B-58 or S522B-41

图6 细菌处理丢糟后丢糟淀粉含量变化趋势Fig.6 Starch content trend of waste distiller's grains inoculated with G7B-58 or S522B-41

总体上，菌悬液生长可使丢糟水分含量略微上升，如图4所示，S522B-41可使丢糟水分含量上升1.3%，G7B-58可使丢糟水分含量上升1.6%后随即下降，最终使水分含量上升2.5%，扣除水分自然蒸发量，新增加的水大部分由细菌代谢产生，表明丢糟内存在旺盛的细菌代谢，且两株菌的代谢情况有一定差异，由于对多种碳源的优先利用不同，G7B-58菌株可能存在两个代谢高峰。

两株菌对丢糟酸度的影响如图5所示，接种菌株后丢糟酸度在第4天左右均有明显上升，但随即明显降低，如G7B-58菌株处理丢糟后丢糟酸度在6 d后趋于稳定，对S522B-41菌株来说，处理8 d后仍有继续降低的趋势。总体上，S522B-41菌株降低丢糟酸度的效果更好。

细菌对丢糟的中淀粉含量的影响主要是对淀粉的利用，同时还可以通过分解纤维素，使被纤维素包裹的淀粉释放出来从而增加丢糟中淀粉含量，但总体上丢糟淀粉在细菌作用下明显降低，两株菌对丢糟淀粉含量的影响见图6，接种前2天变化幅度较小，两株菌分别从第2天（S522B-41）、第 4天（G7B-58）开始大量利用丢糟中的淀粉，到接种6 d时趋于稳定，推测剩余淀粉在纤维素含量不继续降低的情况下已很难被利用。

在丢糟环境中，影响还原糖含量的主要因素包括菌株对糖的消耗及淀粉、纤维素的分解导致还原糖含量上升，两株菌对丢糟含糖量的影响见图7。

图7 细菌处理丢糟后丢糟还原糖含量变化趋势Fig.7 Reducing sugar content trend of waste distiller's grains inoculated with G7B-58 or S522B-41

对S522B-41菌株，0～2 d内丢糟含糖量明显上升，可能是由淀粉分解所致（这与该时间段内丢糟内淀粉开始降解的现象一致），2 d后，还原糖含量迅速降低，到第4d已趋近于零，随后又由于淀粉或纤维素的分解而略有上升，到第6天趋于稳定。而G7B-58菌株在接种后的前两天首先消耗丢糟中的残糖，2 d内就已经消耗掉大部分残糖，随即开始分解淀粉或纤维素，导致还原糖含量上升，随后又因生长消耗掉大部分还原糖。虽然最终两株菌处理丢糟后均可使丢糟的还原糖含量降至0.1%以下，但在丢糟环境内，S522B-41菌株及G7B-58菌株对糖、淀粉或纤维素的利用优先顺序和难易程度有所不同，从充分利用丢糟碳源的角度来看，S522B-41菌株优于G7B-58菌株。

3 结论与讨论

本研究通过对G7B-58、S522B-41降解丢糟纤维素特性的应用研究，发现这两株菌均可适应丢糟堆积的酸度及温度，仅在室温下喷洒丢糟后简单堆积，不添加任何辅料，就可使丢糟纤维素分别降低16.9%及16.6%，蛋白质含量分别增加35.0%及39.2%，两株菌混合使用时丢糟纤维素降解21.1%，蛋白增加41.1%，同时降低丢糟酸度达86%。在10 kg的堆积规模下，这两株细菌处理丢糟均以2%接种量，堆积6 d为宜，在实际生产中，丢糟量远大于该实验规模，堆内温度更高，可适当降低接种量，采用每层喷洒方式接种。

关于白酒丢糟微生物处理的研究，近二十年来已有大量报道，一般的思路是利用霉菌、酵母酵母的组合菌剂对丢糟进行处理，一般需在丢糟中添加多种营养物质，或者调节丢糟pH，其接种量也较大[9-11]，而白酒丢糟产量巨大，上述处理方式相对较为复杂，在丢糟无害化处理或丢糟饲料生产时，工艺的复杂程度直接影响技术的推广，本研究采用产芽孢细菌菌悬液以较小接种量（2%）直接喷洒丢糟，不用添加其他营养物质，接种2 d内即可完成菌体增殖，6 d内即可达到较好的处理效果，处理方式简便粗放，更适宜中小企业。同时，宜宾浓香型白酒产区丢糟的蛋白含量仅为8.96%，而北方地区的酒糟蛋白含量可达17%～24%[4]，更适宜细菌生长，该菌株在北方酒企的应用效果将更好。

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