COPD患者肺组织中Smad蛋白、TGF-β1表达与气道重塑的关系

管频，陈娟，冯光球，吴洁

(1.海南省人民医院医疗保健中心四区，海南海口 570311；2.海南医学院，海南海口 571199)

·论著·

COPD患者肺组织中Smad蛋白、TGF-β1表达与气道重塑的关系

管频1，陈娟1，冯光球1，吴洁2

(1.海南省人民医院医疗保健中心四区，海南海口 570311；2.海南医学院，海南海口 571199)

目的观察COPD患者肺组织中Smad蛋白、TGF-β1的表达及与气道重塑的相关性。方法标本取自48例因肺部孤立性结节行肺叶切除术患者的肺组织，按术前肺功能分为非COPD组(A组，24例)及COPD组(B组，24例)。所取肺组织HE染色后光镜下观察肺组织的病理形态学改变，以半定量图像分析法测量小气道管壁和平滑肌层厚度。用Western blot法检测肺组织中Smad2、Smad3、Smad7及TGF-β1的表达。结果(1)B组Smad2、Smad3及TGF-β1表达均高于A组，Smad7的表达均高于A组，差异有统计学意义(均P＜0.05)，且Smad2、Smad3蛋白与TGF-β1表达呈正相关(均P＜0.05)，而Smad7蛋白与TGF-β1表达呈负相关(P＜0.05)；(2)肺组织Smad2、Smad3、TGF-β1的表达与单位长度的管壁面积(WAt/Pi，μm2/μm)及单位长度的平滑肌层面积(WAsm/Pi，μ m2/μm)表达均呈正相关(均P＜0.05)；Smad7蛋白与单位长度的管壁面积(WAt/Pi，μm2/μm)及单位长度的平滑肌层面积(WAsm/Pi，μm2/μm)表达呈负相关(均P＜0.05)。结论在COPD肺组织气道重塑中，TGF-β1/Smads信号转导途径是关键，其中Smad3、Smad2发挥调节作用，而Smad7表现出抑制作用。

慢性阻塞性肺疾病；气道重塑；转化生长因子-β1；Smad蛋白

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的病理基础为气道壁和肺实质的慢性炎症及结构的破坏，最终导致了管腔狭窄、肺气肿形成和进行性气流受限，而这一个过程则称之为气道重塑。气道重塑是COPD气流受限的主要病理基础，是COPD病变呈持续发展的关键因素[1-2]。在众多炎症因子及细胞外基质调节因子中，转化生长因子(TGF-β1)是同时具有重要的免疫调节和致纤维化活性，故而在气道炎症及气道重塑中占重要地位[3]。Smads蛋白是TGF-β超家族表达细胞内重要信号转导和调控的分子，可将TGF-β超家族信号由I型受体传递至细胞核内，进而调控靶基因转录，从而发挥他们重要的生物学活性。Smad3通路在调控TGF-β1介导的ECM积聚过程中有十分重要的地位[4]。本文检测COPD组患者外周肺组织TGF-β1、Smad3的表达，从支气管形态学测等方面评价气道重塑，同时了解TGF-β1、Smad3的表达的关系以及与气道重塑指标的相关性，探讨TGF-β1/Smads信号转导途径在COPD气道重塑中的作用。

1 材料与方法

1.1 取材标本取自于2011年4～11月期间因发现肺部孤立性结节于我院胸外科住院拟行肺叶切除术的48例患者(入选患者近6周内无急性加重)。实验所需的肺组织取远离肺癌病灶5 cm以上、无肿瘤浸润的外周肺组织。按术前一周的肺功能结果分为非COPD组(24例)及COPD组(24例)。COPD的诊断符合慢性阻塞性肺疾病诊治指南[1]。两组患者的年龄、性别等比较差异无统计学意义。患者均除外先天性心脏病、左心疾病、COPD以外的其他肺疾病以及全身其他系统慢性病变。

1.2 标本采集及HE染色处理手术取下肺组织标本，迅速用10%福尔马林充分浸泡固定12 h，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋。取上述人肺组织石蜡块，切片(5 μm)、HE染色后光镜下观察其病理形态学改变。

1.3 支气管形态学测量方法随机选取HE切片中内周长＜2 mm、长径/短径≤2较规整的小支气管，每个标本选3～6个支气管横截面积，采用META MORPH图像分析系统(美国Universal Imaging Corporation)进行以下测量：管壁总面积(WAt)=气道外壁所围面积(Ao)-管壁内侧的面积(Ai)，平滑肌层面积(WAsm)=平滑肌层外侧面积(Asmo)-平滑肌层内侧面积(Asmi)，然后以管壁内周长(Pi)进行标准化，结果以单位长度的管壁面积(WAt/Pi，μm2/μm)表示管壁厚度，同样以单位长度的平滑肌层面积(WAsm/Pi，μm2/μm)表示平滑肌层厚度[5]。

1.4 Western blot法检测外周气道肺组织Smad蛋白、TGF-β1蛋白质表达采用Western blot法检测外周气道肺组织的Smad3(分子量48 kD)、Smad2 (分子量52 kD)、Smad7(分子量46 kD)、TGF-β1(分子量12.5 kD)的表达，以GAPDH为内参蛋白(分子量36 kD)。应用RIPA蛋白裂解液从肺组织中提取蛋白质，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度后于-80℃保存。取蛋白样品加等体积的2×电泳样品缓冲液加热变性后，以20 μg蛋白/泳道上样，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后电转移至硝酸纤维膜。予丽春红S染色确定转膜情况并标记蛋白质标准参照物位置。用5%脱脂奶粉封闭后，先后加入一抗(Smad3、Smad2抗体、Smad7抗体或TGF-β1抗体)及辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB显色剂显色，结果：阳性区域显深棕色。拍摄滤膜照片，并扫描灰度值，Smad2/GAPDH、Smad 3/GAPDH、Smad7/ GAPDH、TGF-β1/GAPDH吸光度比值来表示，见图1。

图1 免疫印迹法：两组肺组织Smad蛋白、TGF-β1的表达

2 结果

2.1 受试者的一般情况及肺功能资料两组受试者性别、年龄之间差异无统计学意义(P＞0.05)。两组支气管形态学测量结果见表1。COPD组管壁厚度、平滑肌厚度均明显高于非COPD组(P＜0.05)。

表1 两组受试者一般资料及病理学资料比较()

表1 两组受试者一般资料及病理学资料比较()

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2.2 两组所取外周肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的表达比较COPD组TGF-β1和Smad2、Smad3的表达均高于非COPD组(P＜0.05)，但Smad7的表达低于非COPD组(P＜0.05)，见表2。

表2 两组TGF-β1、Smad蛋白的表达差异比较(，kD)

表2 两组TGF-β1、Smad蛋白的表达差异比较(，kD)

2.3 相关分析外周肺组织TGF-β1表达与Smad2、Smad3的表达呈正相关(r=0.737、0.496，P＜0.000)，与Smad7的表达呈负相关(r=0.547，P＜0.000)。TGF-β1与管壁厚度(WAt/Pi)、平滑肌厚度(WAsm/Pi)呈正相关(r值分别为0.744、0.711，P＜0.000)，但Smad7的表达与二者均呈负相关(r值分别为0.576、0.483，P＜0.000)。Smad2、Smad3的表达与管壁厚度(WAt/Pi)均呈正相关(r值分别为0.673、0.528，P＜0.000)，Smad2、Smad 3的表达与平滑肌厚度(WAsm/Pi)均呈正相关(r值分别为0.683、0.481，P＜0.000)。

3 讨论

COPD是肺组织对于有害颗粒或气体产生的异常炎性免疫反应相关的复杂综合征，大量的实质、炎症细胞和细胞因子参与了COPD的发生和发展过程[6]。TGF-β1是一种多效性细胞因子，参与包括COPD在内的多种肺疾病的发病机制，其升高不仅仅早于肺功能异常及病理形态异常，且与疾病严重呈正相关[7]，本文的结果也再次验证了这一点。

TGF-β1在细胞外基质活化后通过Smad信号转导途径，调节着如例如Th2、Th17的功能，特别是Treg (调节性T细胞)及成纤维细胞来促进炎症反应、合成细胞外基质蛋白及促进胶原沉积等[3]，从而引起气道修复、重塑，也就是说，TGF-β1/Smad是气道重塑这个过程的关键[8]。Smads蛋白根据其结构和功能的不同分为三类：第一类为受体调节型Smads蛋白，包括Smadl、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8；第二类为通用调节型Smads蛋白即Smad4；第三类是抑制型Smads蛋白，包括Smad6和Smad7[9]。研究证实TGF-β1主要通过TGF-β1/Smads途径发挥生物学效应，活性的TGF-β1结合并激活Ⅱ型/I型TGF-β1受体，活化的受体进一步激活Smads家族中的Smad3和Smad2，然后其聚集成共同复合物或形成数个异源二聚体，进入细胞核内与特异的DNA连接蛋白结合，直接启动靶基因转录，从而引起气道壁细胞外基质沉积和血管的平滑肌细胞增殖及表型转化等一系列变化[10-11]。

在研究结果中发现，COPD组患者肺组织TGF-β和Smad2、Smad3的表达均明显高于非COPD组，而Smad7的表达却低于非COPD组，而且TGF-β和Smad3、2的表达与气道壁厚度、气道平滑肌厚度等呈正相关，而Smad7与二者呈负相关，进一步说明COPD气道重塑程度中TGF-β1/Smads信号转导途径中Smad3、Smad2发挥的调节作用，而Smad7表现出抑制作用。TGF-β1/Smads信号转导途径中Smad蛋白家族可能是改善COPD气道重塑的重要治疗靶点。

[1]柳涛,蔡伯蔷.慢性阻塞性肺疾病诊断、处理和预防全球策略(GOLD2011年修订版)介绍[J].中国呼吸与危重监护杂志,2012, 11(1):1-12.

[2]Decramer M,Janssens W,Miravitlles M.Chronicobstructive pulmonary disease[J].Lancet,2012,379(9823):1341-1351.

[3]Yang YC,Zhang N,Van Crombruggen K,et al.Transforming growth factor-beta1 in inflammatory airway disease:a key for understanding inflammation and remodeling[J].Allergy,2012,67 (10):1193-1202.

[4]周语平,杨成林.理肺化纤方对肺纤维化大鼠的防治作用及对TGF-βl/Smad3信号转导通路的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2011,17(12):151-155.

[5]武红莉,冯淬灵,武维屏.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型气道炎症与重塑的实验研究[J].中日友好医院学报,2006,20(2):95-98.

[6]Yao H,de Boer WI,Rahman I.Targeting lung inflammation:novel therapies for the treatment of COPD[J].Curr Respir Med Rev, 2008,4:57-68.

[7]Konigshoff M,Kneidinger N,Eickelberg O.TGF-beta signaling in COPD:deciphering genetic and cellular susceptibilities for future therapeutic regimen[J].Swiss Med Wkly,2009,139:554-563.

[8]Groneberg D,Witt H,Adcock,et al.Smads as intracellular mediators of airway inflammation[J].Experimental Lung Research, 2004,30:223-250.

[9]Kim DY,Kwon EY,Hong GU,et al.Cigarette smoke exacerbates mouse allergic asthma through Smad proteins expressed in mast cells[J].Respir Res,2011,12:49.

[10]Zhao W,Gomez G,Yus H,et al.TGF-betal attenuates mediator release and de novo Kit expression by human skin mast cells through a Smad-dependent pathway[J].J Immunol,2008,181(10):7263-7272.

[11]Turner NJ,Jones HS,Davies JE,et a1.Cyclic stretch-induced TGF-betal/Smad signaling inhibits adipogenesis in umbilieal cord progenitor cells[J].Bioehem Biophys Res Commun,2008,377(4): 1147-1151.

Relationship between the expression of Smad protein and transforming growth factor beta-1 and the airway remodeling in lung parenchymal of patients with COPD.

GUAN Pin1,CHEN Juan1,FENG Guang-qiu1,WU Jie2.
1.Medical Care Center,Pepole's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2.Hainan Medical Univesity,Haikou 571199,Hainan,CHINA

>ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of TGF-β1and smads in lung parenchymal of patients with COPD.MethodsAccording to the pulmonary function,the patients were divided into two groups:24 patients without COPD and 24 patients with COPD.We observed the histopathological features and measured the thickness of the airway wall and the smooth muscle layer of the small airway by means of semi-quantitatively image analyzer.The expressions of Smad2,Smad3,Smad7 and TGF-β1were determined by western blot.Results(1)There were higher level of Smad2,Smad3 and TGF-β1in patients with COPD than without COPD(P＜0.05,respectively).The level of TGF-β1was positively correlated with those of Smad2 and Smad3 (P＜0.05,respectively),but negatively correlated with that of Smad7.(2)The level of Smad2,Smad3 and TGFβ1were positively correlated with WAt/Pi and WAsm/Pi,respectively,but Smad7 were negatively correlated with WAt/Pi and WAsm/Pi,respectively.ConclusionTGF-β1/Smads signal transduction pathway is the key of airway remodeling in COPD,and Smad2 and Smad3 play the regulatory role,while Smad7 plays the inhibitive role.

Chronic obstructive pulmonary disease(COPD);Airway remodeling;Transforming growth factor beta-1;Smad protein

R563

A

1003—6350（2014）12—1720—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.12.0670

2013-12-11)

海南省自然科学基金（编号：807081）

管频。E-mail：gp0318@126.com