原花青素对急性脊髓损伤大鼠核因子-кB和白细胞介素-6表达的影响

马延仃，谢少华，杨拯，杨海燕，李晓，张艺，梁羽，郭秀娟，张奇兰，张晓

原花青素对急性脊髓损伤大鼠核因子-кB和白细胞介素-6表达的影响

马延仃，谢少华，杨拯，杨海燕，李晓，张艺，梁羽，郭秀娟，张奇兰，张晓

目的观察原花青素对脊髓损伤后大鼠核因子-кB(NF-кB)、白细胞介素-6(IL-6)表达变化的影响。方法36只健康成年Sprague-Dawley大鼠均分为3组：原花青素治疗组(A组)、甲基泼尼松龙治疗组(B组)和对照组(C组)。采用Allen法复制大鼠T9急性脊髓损伤模型，于术后1 d、3 d和7 d对各组大鼠行后肢运动功能BBB评分和斜板试验；免疫组织化学染色检测脊髓NF-кB和IL-6的表达。结果术后3 d、7 d，A组、B组大鼠BBB评分和斜板试验成绩均优于C组(P＜0.05)。A组术后各时间点NF-кB表达均明显低于C组(P＜0.01)，B组术后3 d、7 d的NF-кB表达强度明显低于C组(P＜0.01)。术后各时间点，A、B两组IL-6表达均低于C组(P＜0.05)。结论原花青素可抑制脊髓损伤后大鼠脊髓组织NF-кB、IL-6的表达，有效抑制炎症反应，从而促进大鼠后肢运动功能的恢复。

脊髓损伤；原花青素；运动功能；核因子-кB；白细胞介素-6；大鼠

[本文著录格式]马延仃，谢少华，杨拯，等.原花青素对急性脊髓损伤大鼠核因子-кB和白细胞介素-6表达的影响[J].中国康复理论与实践,2014,20(8):713-717.

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)导致原发性脊髓组织坏死和继发性损伤，严重影响患者的生活质量。研究表明，炎症反应在脊髓继发性损伤中发挥重要作用[1]；如何有效控制脊髓损伤后的早期炎症反应，降低继发性损伤的程度，是保存脊髓功能、改善预后的关键[2]。原花青素(proanthocyanidin)是一种广泛存在于自然界植物中的多酚化合物，由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成。原花青素是清除人体内自由基十分有效的天然抗氧化剂，在抗脂质过氧化和清除自由基，保护心血管、抗炎、抗肿瘤等方面发挥重要作用[3-5]。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级健康成年Sprague-Dawley大鼠36只，雌雄不限，体质量(200±20)g，由成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2008-24。

1.2 试剂和仪器

原花青素购自四川省维克奇生物科技有限公司，批号：120614。注射用甲基泼尼松龙琥珀酸钠购自天津药业焦作有限公司，批号：10031501。注射用青霉素钠购自哈药集团制药总厂，批号：A120802810。氯化钠注射液购自贵州科伦药业有限公司，批号：B121003U。戊巴比妥钠(德国进口分装)购自北京化学试剂公司，批号：100808。兔抗鼠核因子-кB(nuclearfactor kappa B,NF-кB)多克隆抗体(批号：D-C1-07C14B)、SV0002-6兔IgG两步法免疫组化试剂盒(批号：07E04AJ)、DAB显色试剂盒(批号：07D16B22)，购自武汉博士德生物工程有限公司。兔抗鼠白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)多克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司，批号：YEYE22W。BX53F正置荧光显微镜(SN：IE38873，日本)。Image-Pro Plus 6.0病理图像分析软件：USA Media Cybernetics。自制数字式脊髓损伤动物模型制备仪。

1.3 造模与分组

将大鼠以1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯卧位固定于手术台上。背部去毛、消毒铺巾，正中切口显露椎板和棘突，确定T9位置。小心分离并咬除T9棘突，剥离椎板，适当暴露脊髓。采用Allen法以10×25 g⋅mm能量打击脊髓。大鼠即刻出现脊髓打击处充血、尾巴摆动及双下肢不同程度抽搐现象为打击成功标志。逐层消毒并缝合切口，0.9%氯化钠注射液9 ml/kg腹腔注射补液，8×104U青霉素钠腹腔注射预防感染。术后大鼠独笼饲养，自由进食、饮水，保持适宜环境，每天3次挤压排尿，直至大鼠能自主排尿。

36只大鼠均分为三组。造模成功后30min，原花青素治疗组(A组)腹腔注射原花青素40 mg/kg，以后每天1次。甲基泼尼松龙治疗组(B组)腹腔注射甲基泼尼松龙30 mg/kg，以后每6 h注射1次，每次5.4 mg/ kg，共4次。对照组(C组)注射等体积生理盐水，每天1次。

1.4 运动功能观察

于造模后1 d、3 d、7 d，各组选取4只大鼠，进行以下测试。

1.4.1 BBB评分[6]大鼠置于宽敞场地，由对分组不知情的两人观察其后肢运动状况4min，评定BBB评分。取双后肢评分的均值作为评分结果，最终评分值为两评测人员评分的均值。

1.4.2 斜板试验[7]大鼠置于垫有橡胶垫的自制木料斜板上，头朝向斜板抬高侧，身体纵轴与斜板纵轴一致。斜板倾斜角度从0°开始缓慢增大，每次增加1～2°，记录大鼠在斜板上能停留并保持至少5 s时的最大角度。由对分组不知情的两人对每只大鼠测定3次，取均值。最终结果取两人结果的均值。

1.5 组织取材与切片制备

每组各取4只大鼠，于运动功能评测后，以1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉。打开胸腔，充分暴露心脏和主动脉根部。从左心室插管到主动脉根部，剪开右心耳，经左心室快速灌注肝素生理盐水约200 ml，至肝脏及巩膜苍白。4%多聚甲醛150～200 ml灌注40min。以损伤处为中心切取脊髓组织约1 cm，4%多聚甲醛固定24 h。常规脱水、透明、浸蜡、包埋，连续横切，厚5μm，用于免疫组织化学染色。

1.6 免疫组织化学染色

切片常规脱蜡水化，置3%H2O2中孵育10min；水洗3次，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)高压修复90 s。冷却至室温后滴加封闭液，室温下封闭10min。甩去多余液体后，滴加适当稀释的一抗(兔IgG) 4℃过夜，用PBS替代一抗作为阴性对照。NF-кB一抗和IL-6一抗的稀释度分别为1∶200、1∶100。切片复温后，1 mol/L PBS洗涤3次，滴加聚合HRP标记抗兔IgG于37℃中孵育40min，PBS洗涤3次。DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。在显微镜下观察，免疫阳性反应呈棕黄色或棕褐色。每张切片400倍下随机拍摄5个无重复的视野，采用Image-Pro Plus 6.0病理图像分析软件测定每个视野中累积光密度(IOD SUM)和其分布面积(area SUM)，计算平均光密度(AOD)：

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 BBB评分

术前各组大鼠运动功能正常，评分均为21分。术后1 d，A组评分与C组无显著性差异(P＞0.05)。术后3 d、7 d，A、B组评分与C组相比均升高(P＜0.05)。见表1。

2.2 斜板试验

术后1 d，A组与C组无显著性差异(P＞0.05)。术后3 d、7 d，A、B组角度与C组相比均增大(P＜0.05)。见表2。

2.3 NF-кB的表达

C组大鼠术后NF-кB表达明显，且随时间延长呈增强趋势。A、B组术后也有大量NF-кB表达。术后1 d，B组表达与C组无显著性差异(P＞0.05)。术后3 d、7 d，A、B组表达强度与C组相比均明显降低(P＜0.01)。从结果可看出，A组术后1 d、3 d的NF-кB表达有弱于B组的趋势。见表3、图1。

2.4 IL-6的表达

A、B组各时间点IL-6表达均低于C组(P＜0.05)。A组术后1 d、3 d时IL-6表达有弱于B组的趋势。见表4、图2。

表1 各组大鼠BBB评分

表2 各组大鼠斜板试验结果(°)

表3 各组大鼠脊髓组织NF-кB表达(AOD,×10-4)

表4 各组大鼠脊髓组织IL-6表达(AOD,×10-4)

图1 各组大鼠脊髓组织NF-кB的表达(免疫组织化学染色，400×)

图2 各组大鼠脊髓组织IL-6的表达(免疫组织化学染色，400×)

3 讨论

脊髓损伤后继发性损伤出现于原发性损伤后数分钟内，包括损伤局部缺血缺氧、脂质过氧化、钙离子内流、自由基损伤、兴奋性毒性及免疫炎性反应等，可持续数周至数月，所造成的危害远大于原发性损伤。但其机制众说纷纭。

近年来有学者提出，脊髓损伤后的免疫炎性反应可能是继发性脊髓损伤发生机制的核心，是继发性脊髓损伤中其他各种损伤机制的源头，其他各种损伤机制只是免疫炎性反应机制的下游过程或结果[8]。脊髓损伤后，外源性炎性细胞活化并穿过血脑屏障，迁移、浸润到损伤区，同时活化胶质细胞，释放大量炎性因子加重炎症反应，发挥神经毒性作用，造成神经元和少突胶质细胞凋亡、坏死，受损脊髓局部空洞和胶质瘢痕形成等一系列病理改变[9]。有效抑制脊髓损伤后过度的炎症反应一直是研究的热点。

NF-кB是众多细胞因子和炎症介质表达的主要转录因子，在细胞炎性反应、神经营养因子的调节、巨噬细胞活化、细胞凋亡[10-11]等过程中起着重要作用。NF-кB被激活是急性脊髓损伤继发性损伤的重要分子机制。急性脊髓损伤后NF-кB表达的大幅度上调既可促使肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-1等促炎因子基因过度表达，又是IL-1β和TNF-α表达诱导的结果。这个能放大且延续炎症反应的正反馈环导致广泛促炎基因表达，加重炎症反应和对损伤脊髓的损害。研究表明，阻断NF-кB的活化可减轻脊髓损伤后引起的一系列继发性损伤[12]；NF-кB亚基的不同组合形式在炎症反应中充当不同角色[13-14]。研究显示，急性脊髓损伤后6 h，白质内胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达开始增强；5 d时灰白质内GFAP阳性细胞仍大量存在，而NF-кB表达在急性脊髓损伤后1 h可检测到，5 d时明显减弱[15]；抑制星形胶质细胞中的NF-кB，炎性反应得到减弱，脊髓功能恢复较好[16]。推测NF-кB可能参与脊髓损伤后GFAP的表达，调节反应性胶质增生，控制炎症反应。

炎性细胞因子可调控巨噬/小胶质细胞的自身活化及极化状态，影响神经再生和功能[17-18]。其中，具有致炎和抗炎双向功能的白介素家族成员IL-6不可忽视，但其在脊髓继发性损伤过程中的角色存在争议。有学者认为，IL-6加重脊髓继发性损伤。脊髓损伤早期损伤区增多的IL-6可促进TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达，进而促进炎性细胞浸润到损伤局部，抑制神经功能的恢复[19-20]。研究显示，IL-6的短暂阻滞可下调脊髓损伤早期其他炎症因子的表达，减轻炎症反应，促进功能恢复[21]。虽然研究已表明IL-6在脊髓损伤早期主要发挥其致炎作用，但作用机制尚不清楚。另有学者提出，IL-6可减轻脊髓继发性损伤，在一定程度上保护受损脊髓。脊髓损伤后30min全身应用IL-6，可使Bcl-2表达明显增强，而Fas表达减弱，推测IL-6可有效调控神经细胞的凋亡，减轻继发性损伤[22]。

本研究结果显示，术后3 d、7 d，原花青素治疗大鼠运动功能恢复较好。术后1 d、3 d、7 d，原花青素治疗大鼠脊髓组织中NF-кB和IL-6的表达均明显减弱。推测原花青素可通过抑制NF-кB、IL-6的表达，有效控制脊髓损伤后的炎症反应，进而促进大鼠运动功能的恢复。

对于有争论的IL-6，本实验结果表明，在一定程度上抑制脊髓损伤后IL-6的过度表达可促进大鼠后肢运动功能恢复，脊髓损伤后过度表达的IL-6参与炎症反应及脊髓继发性损伤。本研究还发现，原花青素在术后1 d、3 d对NF-кB和IL-6的表达抑制情况有强于甲基泼尼松龙的趋势，说明原花青素可能具有较好的抑制脊髓损伤后早期炎症反应的作用。

原花青素作为一种高效、低毒、高生物利用度、强抗氧化活性和自由基清除功能等多种良好生物活性的天然提取物，已在欧洲、美国、日本等国家和地区广泛应用于食品、保健、药品等领域[23-24]，具有巨大的研究价值和开发潜力。然而，目前对原花青素的药理作用及其机制研究不够全面深入，临床使用的原花青素药品少见。本研究结果显示，原花青素可抑制脊髓损伤后的炎症反应，有效促进大鼠运动功能的恢复，说明原花青素在脊髓损伤的治疗中有广阔前景。我国拥有漫长的中医药研究历史和丰富的原花青素植物资源，充分发挥我国优势开展相关原花青素研究和开发，将为临床脊髓损伤的药物治疗提供新思路。

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Effect of Proanthocyanidin on Expression of Nuclear Factor kappa B and Interleukin-6 in Rats after Spinal Cord Injury

MA Yanding,XIE Shao-hua,YANG Zheng,YANG Hai-yan,LI Xiao,ZHANG Yi,LIANG Yu,GUO Xiu-juan,ZHANG Qi-lan,ZHANG Xiao.Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China

ObjectiveTo observe the effect of proanthocyanidin on the expression of nuclear factor kappa B(NF-кB)and interleukin-6 (IL-6)in rats with spinal cord injury(SCI).Methods36 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into proanthocyanidin treatment group(group A,n=12),methylprednisolone(MP)treatment group(group B,n=12)and model control group(group C,n=12).Allen's method was used to establish the model of acute spinal cord injury in T9.On the 1st,3rd and 7th days after operation,4 rats in each group were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scale and Slanting Board Test(SBT),and the expression of NF-кB and IL-6 of the spinal cord were detected with immunohistochemistry.ResultsThe scores of BBB and SBT were better in groups A and B than in the group C 3 and 7 days after SCI(P＜0.05).Compared with group C,the expression of NF-кB in group A decreased all the time after SCI(P＜0.01),and 3 and 7 days after SCI in group B(P＜0.01);while the expression of IL-6 decreased all the time after SCI in groups A and B(P＜0.05).ConclusionProanthocyanidin may inhibit the expression of NF-кB and IL-6 in spinal cord after SCI in order to reduce inflammation and improve the hindlimb motor function in rats after SCI.

spinal cord injury;proanthocyanidin;motor function;nuclear factor kappa B;interleukin-6;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.08.003

R651.2

A

1006-9771(2014)08-0713-05

2013-06-28

2013-07-25)

1.2013年国家级大学生创新实验计划项目(No.201313705002)；2.成都医学院大学生创新实验计划项目(No.CXXS201307)。

成都医学院，四川成都市610500。作者简介：马延仃(1992-)，女，汉族，河南汝州市人，大学本科生。通讯作者：张奇兰、杨拯。E-mail:yzixjj@163.com(杨拯)。