脊髓康对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复及脑源性神经营养因子表达的影响

郭杨，马勇,2，潘娅岚，成吉华，黄桂成

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脊髓康对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复及脑源性神经营养因子表达的影响

郭杨1，马勇1,2，潘娅岚1，成吉华1，黄桂成1

目的探讨脊髓康对脊髓损伤(SCI)后神经功能恢复以及脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白和mRNA表达的影响。方法144只雌性Sprague-Dawley大鼠，体质量180～220 g，随机抽取24只作为假手术组，仅咬除T9～T11段椎板、棘突。其余采用改良Allen法成功建立SCI动物模型后，随机分为5组，即模型组、醋酸泼尼松组及脊髓康高、中、低剂量组，每组24只。脊髓康高、中、低剂量组分别按生药剂量50 g/(kg⋅d)、25 g/(kg⋅d)、12.5 g/(kg⋅d)灌胃；醋酸泼尼松组以醋酸泼尼松0.06 g/(kg⋅d)灌胃；假手术组与模型组均以同体积生理盐水灌胃。分别于术后24 h、3 d、7 d、14 d，进行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分、斜板试验，干预后3d、7d、14d处死大鼠取脊髓样本，采用免疫组化、Western blotting、荧光定量PCR法检测脊髓损伤区BDNF蛋白和mRNA的表达情况。结果术后24 h假手术组大鼠BBB评分、斜板试验角度明显高于其他各组(P＜0.01)。术后3～14 d脊髓康中剂量组和醋酸泼尼松组BBB评分均高于模型组(P＜0.05)，且术后14 d脊髓康中剂量组BBB评分明显高于其他各组(P＜0.01)。免疫组化和Western blotting显示，不同时间点醋酸泼尼松组和脊髓康中剂量组BDNF蛋白表达水平均明显高于模型组(P＜0.01)，二者具有等效性(P＞0.05)。荧光定量PCR显示，醋酸泼尼松、脊髓康可促进SCI后脊髓损伤区BDNF mRNA的表达，早期醋酸泼尼松效果较为明显，而干预后14 d脊髓康中剂量效果明显优于醋酸泼尼松。结论脊髓康可促进大鼠SCI后神经功能的恢复，提升SCI后脊髓内BDNF蛋白及mRNA的表达水平。

脊髓损伤；脊髓康；轴突再生；微环境；脑源性神经营养因子；大鼠

[本文著录格式]郭杨，马勇，潘娅岚，等.脊髓康对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复及脑源性神经营养因子表达的影响[J].中国康复理论与实践,2014,20(8):701-708.

轴突再生微环境紊乱是脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经再生障碍的重要原因，其影响因素包括炎症反应、胶质瘢痕形成、神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)缺乏及诸多抑制性因子的存在等[1]。寻找合理的治疗方案改善轴突再生微环境，已成为SCI的研究热点。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是NTFs家族中的重要成员，可调控多种神经元的生长发育和分化，诱导轴突再生，抑制神经元凋亡[2]。

脊髓康是在中医“肾督同治”理论指导下，结合多年的临床实践而形成的验方，具有“祛瘀通督，温肾利湿，调和气血”之功效。前期研究证实，脊髓康可抑制脂质过氧化，清除氧自由基，改善损伤局部微环境[3-5]。据此推测，脊髓康这一效应可能与其促进BDNF等相关神经营养因子表达有关。

本研究旨在观察脊髓康对SCI大鼠神经功能恢复及BDNF表达的影响，进一步验证其治疗SCI的有效性，并探索其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

144只清洁级Sprague-Dawley大鼠，雌性，体质量180～220 g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2008-0033。按5只/笼饲养于南京中医药大学动物实验中心，自由进食、饮水。

随机抽取24只大鼠作为假手术组，其余120只大鼠造模成功后采用随机数字表法随机分为5组，即模型组，醋酸泼尼松组及脊髓康高、中、低剂量组，每组24只。各组大鼠再随机分为3d、7d、14d三个时间点组，每组8只。

1.2 动物模型制备

采用改良Allen法建立大鼠SCI动物模型。10%水合氯醛腹腔麻醉成功后，俯卧位固定于简易固定台上；以T10为中心作“十”字形标记定位；无菌条件下沿正中做2～3 cm纵形切口，暴露T9～T11棘突，切开并掀除两侧椎板，充分暴露T10及部分T9、T11段脊髓背侧硬膜。

自距硬脊膜25 mm高处，将自制脊髓打击装置(不锈钢实心金属棒，直径3mm，高18cm，重10g；带有刻度的玻璃套管，内径4mm，长5cm)沿玻璃套管垂直自由落下，撞击T10段脊髓硬脊膜，撞击能量为25mm×10g，损伤直径为3mm。

撞击成功的标志：脊髓局部肿胀明显，但硬脊膜无破损，硬膜后正中静脉充血增粗，大鼠出现尾巴痉挛性摆动，双后肢呈弛缓性瘫痪。

假手术组仅咬除T9～T11段椎板、棘突，不损伤脊髓。

术毕椎旁肌肉注射4×105U青霉素预防感染，生理盐水冲洗切口，逐层缝合，外敷红霉素软膏。

1.3 主要试剂

Envision免疫组化检测试剂盒(福建迈新生物技术有限公司)；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云生物技术有限公司)；#4970S兔抗鼠βactin单克隆抗体(CST，美国)；ab108319兔抗鼠BDNF单克隆抗体(ABCAM，美国)；BS13278羊抗兔二抗(BIOWORLD，美国)；牛血清白蛋白(ROCHE，美国)；29∶1丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺混合物(ACRBIS)、0.22μm PVDF膜(BIO-RAD，美国)；预染蛋白Marker(GENEDIREX，中国台湾)；ECL化学发光底物(THERMO，美国)；RR036A逆转录反应试剂盒、PR820A荧光定量反应试剂盒(TAKARA，宝生物工程有限公司)。

1.4 主要仪器

旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；酶联免疫检测仪(PE-PerkinElmer，美国)；高速台式冷冻离心机、面包式离心机(EPPENDORF，德国)；Transblot®SD蛋白半干转印仪(BIO-RAD，美国)；Image Quant LAS4000mini化学发光成像仪(GE，美国)；蛋白核酸分析仪、PCR自动系列化分析仪(EPPENDORF，德国)；7500实时荧光定量PCR仪(APPLIED BIOSYSTEMS)。

1.5 实验药物制备

1.5.1 中药脊髓康药液中药脊髓康复方主要由生黄芪、当归、川芎、丹参、地鳖虫、赤芍、仙灵脾、制大黄等组成，分别按生药剂量2.5 g/ml、1.25 g/ml、0.625 g/ml于南京中医药大学第一临床医学院临床医学实验研究中心制成水煎剂，4℃保存备用，其中生药购自南京中医药大学附属医院药剂科。

1.5.2 0.3%醋酸泼尼松片(强的松片)药液取醋酸泼尼松片300 mg(5 mg/片，天津药业集团新郑股份有限公司)，研磨成粉末，溶于100 ml生理盐水中，涡旋混匀，4℃保存备用。

1.6 动物护理及干预

各组SCI大鼠均于术后按摩下腹部，挤压膀胱助其排尿排便，注意预防切口感染。

各组大鼠麻醉苏醒后30min即开始给予相应的处理。采用“按动物体表面积比率换算等计量法”计算各处理药物的临床等效剂量，醋酸泼尼松组给予临床等效剂量0.06g/(kg⋅d)，脊髓康中剂量组为临床等效剂量25 g/(kg⋅d)，高剂量组给药50 g/(kg⋅d)，低剂量组给药12.5 g/(kg⋅d)。各组大鼠均按体积20 ml/(kg⋅d)灌胃给药，每日剂量分两次灌胃。假手术组和模型组均给予同等剂量的生理盐水灌胃。各实验组分别按时间点在最后1次灌胃后2 h处死取材。

1.7 观察指标

1.7.1 神经功能评价

1.7.1.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分BBB评分标准以原英文版为主[6]，参考傅强等[7]制定。

分别于术后24 h、3 d、7 d、14 d，由对分组情况不知情的两人独立观察记录，对各组大鼠后肢进行BBB运动功能评分。

1.7.1.2 斜板试验将大鼠置于一个长方形木制斜板上，大鼠身体纵轴线与斜板纵轴垂直位放置，逐渐升高斜板高度，以大鼠能够在斜板上停留5 s的最大角度为功能值，每只大鼠测3次，取其平均值为最终测定角度。

分别于术后24 h、3 d、7 d、14 d，对各组大鼠进行斜板试验。

1.7.2 标本制备分别于干预后3 d、7 d、14 d，每组随机抽取3只大鼠，采取心脏灌注固定法进行取材。迅速沿原切口暴露脊髓，于损伤脊髓中心头、尾侧各1 cm处切断脊髓，置于4%多聚甲醛中固定24 h，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，行石蜡包埋，在距离脊髓直接损伤处5 mm部位连续进行厚约4～5μm的超薄切片，每个样本10张，待免疫组化用。

干预后3 d、7 d、14 d，每组剩余大鼠同上取出脊髓标本，放入冰冷生理盐水中冲洗干净，液氮速冻后转移至-70℃冰箱保存，用于Western blotting和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)。

1.7.3 免疫组织化学法取上述石蜡切片，按Envision法进行免疫组织化学染色，主要步骤如下。

常规脱蜡至水，灭活内源性过氧化物酶，3% H2O2室温封闭，滴加抗原修复液修复，滴加一抗(1∶250)室温孵育60min，每张切片加聚合物增强剂(试剂A)50 μl，室温孵育20min，再加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)50 μl，室温孵育30min，DAB显色，苏木素复染，0.1%盐酸分化，用梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。在200倍光镜下观察拍片，以淡黄色或棕黄色颗粒染色为阳性表达。每张切片随机选取5个视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，以平均光密度值(optical density,OD)表示各组BDNF蛋白的相对表达量。

1.7.4 Western blotting法取出脊髓组织，按20 mg组织加入RIAP裂解液150～250 μl与PMSF混合液，球磨仪研磨组织，冰上裂解30min，4℃15000 r/min离心30min，取上清，BCA法蛋白定量并调整使各组总蛋白含量一致，2×上样缓冲液混匀蛋白变性，冷却后放入-70℃冰箱备用。5%浓缩胶及10%分离胶SDSPAGE凝胶电泳，PVDF膜转印，5%TBST脱脂奶粉室温封闭2 h，BDNF一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，羊抗兔二抗(1∶5000)室温孵育2 h，ECL法显色，Image Quant LAS 4000mini超灵敏化学发光成像仪成像。Adobe Photoshop CS5软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白/β-actin条带灰度值比值表示BDNF蛋白相对表达水平。

1.7.5 荧光定量PCR法Genbank上查找大鼠BDNF和内参GAPDH的编码序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物后经BLAST验证，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体序列见表1。

表1 PCR引物序列

Trizol法提取组织总RNA，测定波长260nm与280nm处的吸光度OD值，确定总RNA的纯度和浓度。逆转录反应条件：37℃15min逆转录成cDNA，85℃15 s、35℃30 s灭活逆转录酶。参照TakaRa荧光定量试剂盒，按照ABI 7500荧光定量PCR仪操作说明，设定两步法荧光定量PCR扩增程序，反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，上述变性、退火步骤循环40次。随后进行建立熔解曲线反应：95℃15 s，60℃1min，95℃15 s。采用2-△△Ct法分析BDNF基因在脊髓组织中的相对表达量。

1.8 统计学方法

所得数据采用SPSS 17.0统计软件包进行分析，正态分布定量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析和LSD法比较；偏态分布定量资料以中位数M和四分位数(Q1,Q3)描述，采用Mann-WhitneyU或Kruskal-WallisH非参数检验。显著性水平α＝0.05。

2 结果

2.1 BBB评分

经Kruskal-WallisH统计分析，术后24 h假手术组BBB评分显著高于其他各组(χ2=28.073,P＜0.001)，经Mann-WhitneyU检验，其他各损伤组间BBB评分无显著性差异(P＞0.05)。

术后3 d各损伤组大鼠后肢仍拖行，醋酸泼尼松组、脊髓康高、中剂量组BBB评分均高于模型组(P＜0.01,P=0.017,P＜0.01)，而前三组间比较无显著性差异(P＞0.05)。术后7 d各治疗组大鼠的后肢活动均有明显改善，较模型组均明显有力(P＜0.01)；而脊髓康中剂量组与醋酸泼尼松组相比无显著性差异(P=0.479)。术后14 d，醋酸泼尼松组、各脊髓康治疗组BBB评分均高于模型组(P＜0.05)，且脊髓康中剂量组明显高于醋酸泼尼松组(P＜0.01)。见表2。

2.2 斜板试验

术前各组大鼠斜板试验角度比较，F=1.536，P= 0.215。术后24 h，各组大鼠斜板试验角度较假手术组均明显降低(P＜0.01)。LSD比较显示，醋酸泼尼松组、脊髓康各剂量组与模型组均无显著性差异(P＞0.05)。术后3 d，醋酸泼尼松组、脊髓康中剂量组大鼠斜板试验角度高于模型组(P=0.002,P=0.016)，而两组间相比无显著性差异(P=0.474)。术后7 d和14 d，醋酸泼尼松组、脊髓康中剂量、低剂量组大鼠斜板试验角度均明显高于模型组(P＜0.01)，且脊髓康中剂量组明显优于醋酸泼尼松组(P=0.006,P=0.002)。见表3。

2.3 BDNF蛋白免疫组化

假手术组脊髓损伤区各时间点BDNF均有少量表达。SCI后BDNF表达迅速增强，术后各时间点模型组及各治疗组阳性细胞数较假手术组增多。模型组术后BDNF表达水平早期逐渐升高，14 d后略有下降趋势，与假手术组相比无显著性差异(P=0.119)，而醋酸泼尼松组、脊髓康中剂量组术后3 d、7 d变化趋势逐渐增强，14 d时仍显著高于假手术组，且与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)。醋酸泼尼松组、脊髓康组中剂量组相比无显著性差异(P=0.983,P=0.177,P= 0.291)，但14 d后可看出脊髓康中剂量组升高趋势较醋酸泼尼松组明显。见表4、图1～图3。

2.4 BDNF蛋白Western blotting

模型组及各治疗组术后BDNF蛋白变化趋势基本同免疫组化结果，术后3 d假手术组BDNF蛋白条带灰度值均低于其他各组，但仅脊髓康中剂量组与假手术相比有显著性差异(P=0.032)。术后7 d除脊髓康高剂量组外，各组BDNF条带灰度值仍高于假手术组，醋酸泼尼松组、脊髓康中剂量组与模型组相比有非常高度显著性差异(P＜0.001)。术后14 d，模型组BDNF条带灰度值变化不大，而醋酸泼尼松组、脊髓康中剂量、低剂量组仍维持在较高水平，且醋酸泼尼松组、脊髓康中剂量组与模型组相比有非常高度显著性差异(P＜0.001)。见表5和图4。

2.5 BDNF mRNA表达

术后3 d，醋酸泼尼松组BDNF mRNA表达水平明显高于模型组(P=0.001)，脊髓康中剂量组BDNF mRNA的相对表达量也高于模型组，但无显著性差异(P=0.066)；术后7 d，醋酸泼尼松组、脊髓康中剂量组的BDNF mRNA表达水平均高于模型组(P=0.026,P=0.048)，而两组间比较无显著性差异(P=0.733)；术后14 d，醋酸泼尼松组、脊髓康中剂量组的BDNFmRNA表达水仍高于模型组，其中脊髓康中剂量组明显高于模型组(P＜0.01)，且明显高于醋酸泼尼松组(P= 0.003)。见表6。

表2 各组大鼠不同时间点BBB评分结果

表3 各组大鼠不同时间点斜板试验结果(°)

表4 各组大鼠SCI后脊髓损伤区BDNF免疫组化阳性表达水平(OD)

表5 各组大鼠SCI后脊髓损伤区BDNF蛋白相对表达水平(灰度比)

表6 各组大鼠SCI后脊髓损伤区BDNF mRNA相对表达量

图1 各组大鼠SCI后3 d脊髓损伤区BDNF蛋白表达(免疫组化染色，200×)

图2 各组大鼠SCI后7 d脊髓损伤区BDNF蛋白表达(免疫组化染色，200×)

图3 各组大鼠SCI后14 d脊髓损伤区BDNF蛋白表达(免疫组化染色，200×)

图4 各组大鼠SCI后脊髓损伤区BDNF蛋白表达显影

3 讨论

一般认为，SCI后引起的功能下降主要由原发性和继发性损伤共同造成，并可能以后者作用更为严重[8]。继发性损伤包括各种致炎细胞因子引发的炎症反应以及SCI后各种因素促发胶质细胞的活化和瘢痕组织的形成等，都直接或间接地影响神经再生微环境。由此可见，如何有效改善SCI后的微环境已成为促进轴突再生的一个关键问题。

NTFs是轴突再生微环境中的一组重要因子，除对中枢神经系统有营养作用外，还可能参与中枢神经系统损伤后的修复，如生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、BDNF、神经营养素等[9-11]，其中BDNF是目前研究最为广泛和深入的NTFs之一。研究表明，BDNF可诱导神经干细胞(neural stem cells, NSCs)增殖、分化，调节自由基代谢，减少自由基积聚，保护神经元免受自由基的攻击[12-13]。研究发现，SCI后损伤脊髓局部BDNF免疫反应阳性星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞数量显著增加，SCI后1 d和1周，大多数少突胶质细胞呈BDNF免疫反应阳性，提示BDNF与SCI后脊髓修复关系密切[14]。

现代中医学者将SCI病机归纳为：瘀血阻滞督脉，枢机统率失职，导致督脉和其他经络、脏腑、气血之间的功能紊乱[15]。究其根本，与督脉的物质基础，即肾精密切相关。我们结合多年的临床实践，将SCI的病因病机归纳为肾督虚损，瘀阻督脉，枢机统率失职，并充分重视督脉、肾精在脊髓损伤及修复中的积极意义，构建“肾督同治”理论以指导中医药促进神经功能重塑，并筛选出具有“祛瘀通督，温肾利湿，调和气血”之功的中药复方脊髓康。方中黄芪为君药，补脾胃之元气，以资气血生化之源；当归为臣药，养血和营；川芎为臣药，行气活血止痛；丹参、赤芍活血化瘀通络，清热凉血；水蛭、蜈蚣、地鳖虫破瘀散结，通络止痛；仙灵脾、肉苁蓉、益智仁补益肾阳，培本固元；大黄、厚朴、枳实泻热通便，行气散瘀；茯苓、泽兰、泽泻、车前子利水渗湿，清热通淋，全方共奏活血化瘀，泻下清热，通利督脉，温肾利湿之功。前期研究已证实，脊髓康能够抑制一氧化氮合成酶表达，降低一氧化氮、丙二醛、肿瘤坏死因子α含量，提高超氧化物歧化酶、白细胞介素-10活性，清除氧自由基，改善轴突再生微环境，防止脊髓继发性损伤[3-5]。

本研究结果显示，术后24 h各组大鼠BBB评分、斜板试验角度明显低于假手术组(P＜0.01)。术后3～14 d，脊髓康中剂量组与醋酸泼尼松组BBB评分均高于模型组(P＜0.05)。术后14 d，脊髓康中剂量组BBB评分明显高于其他各组，且明显优于醋酸泼尼松组(P＜0.01)。综合BBB评分和斜板试验结果，可以看出醋酸泼尼松、脊髓康均可促进SCI大鼠术后后肢运动功能的恢复。

正常成年大鼠脊髓组织内BDNF蛋白表达较弱。本研究显示，SCI后脊髓损伤区BDNF都有不同程度的升高，说明SCI后机体可自我保护性促进BDNF的分泌，但维持时间均较短。这与相关的文献报道相一致。本实验结果提示，术后不同时间点醋酸泼尼松组及脊髓康组BDNF蛋白及其mRNA表达水平较模型组均有显著升高，术后7～14 d仍维持在较高水平。这也提示SCI后神经元的生理活动需要更多的BDNF来维持。同时也表明，SCI后BDNF分泌增加较为缓和，能在较长时间内维持高水平表达，提示其主要在脊髓损伤的中晚期发挥作用。结果显示脊髓康可有效促进SCI大鼠BDNF的表达，而早期上调BDNF的作用缓慢，长期服用，药效作用持久，与醋酸泼尼松相比具有优势。这与脊髓康对大鼠SCI后运动功能恢复的影响趋势基本一致，提示脊髓康可能是通过增强BDNF的表达，改善损伤脊髓再生的微环境，从而促进损伤后运动功能的恢复。

尽管本实验取得一定进展，但是由于观察周期较短，难以评价中药脊髓康促进SCI后神经功能恢复的远期疗效。同时未能与目前疗效确切并应用于临床的甲基泼尼松龙(甲基强的松龙)对比，对脊髓康促进SCI后BDNF的表达而改善轴突再生微环境的具体分子途径及机制尚不清楚。这也是我们下一步的研究方向。

[1]Yuan Y,Su Z,Pu Y,et al.Ethyl pyruvate promotes spinal cord repair through ameliorating the glial microenvironment[J].Br J Pharmacol,2011,164(6):1573-1576.

[2]Lin J,Wang C,Wu Z.Preliminary study on effects of human brain-derived neurotrophic factor gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells by intravenous transplantation on structure and function of rat injured spinal cord[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2010,24(8):982-987.

[3]Jian WW,Mao W,Gui CH.Effect of Jisuikang on kinetic dysfunction in patients after spinal injury[J].Chin J Integr Med, 2008,14(3):190-193.

[4]周建中,马勇,殷韶健,等.中药脊髓康治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[J].江西中医学院学报,2009,21(2):71-74.

[5]Ma Y,Zhou JZ,Yang WG,et al.Effect of Jisuikang on hemorheology and inflammatory factors in rats following spinal cord injury[J].Neural Regeneration Res,2008,3(11): 1176-1180.

[6]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurotrauma,1995,12(1):1-21.

[7]傅强,侯铁胜,鲁凯伍,等.大鼠胸段脊髓损伤后后肢运动功能不同评价标准的比较研究[J].中国脊柱脊髓杂志,2001,11 (5):278-281.

[8]Rossignol S,Frigon A.Recovery of locomotion after spinal cord injury:some facts and mechanisms[J].Annu Rev Neurosci,2011,34:413-440.

[9]Weishaupt N,Blesch A,Fouad K.BDNF:the career of a multifaceted neurotrophin in spinal cord injury[J].Exp Neurol, 2012,238(2):254-264.

[10]Elkelini MS,Bagli DJ,Fehlings M,et al.Effects of intravesical onabotulinumtoxinA on bladder dysfunction and autonomic dysreflexia after spinal cord injury:role of nerve growth factor[J].BJU Int,2012,109(3):402-407.

[11]Novotna I,Slovinska L,Vanicky I,et al.IT delivery of ChABC modulates NG2 and promotes GAP-43 axonal regrowth after spinal cord injury[J].Cell Mol Neurobiol,2011, 31(8):1129-1139.

[12]张任飞,肖诗柔.神经营养素家族类细胞因子对神经干细胞分化影响的研究现状[J].中国科技信息,2011,(2):176-178.

[13]林双竹,杨璐璐,陈稳根,等.神经干细胞与脑源性神经生长因子[J].中国医药指南,2011,11(15):78-80.

[14]Dougherty KD,Dreyfus CF,Black IB.Brain-derived neurotrophic factor in astrocytes,oligodendrocytes,and microglia/ macrophages after spinal cord injury[J].Neurobiol Dis,2000,7 (6 Pt B):574-585.

[15]李盛华,柴喜平,王想福,等.中医药治疗脊髓损伤的研究进展[J].中国中医骨伤科杂志,2010,18(11):70-72.

Effect of Jisuikang on Neural Functional Recovery and Expression of Brain-derived Neurotrophic Factor after Spinal Cord Injury in Rats

GUO Yang,MA Yong,PAN Ya-lan,CHENG Ji-hua,HUANG Gui-cheng.Institute of Traumatology&Orthopedics,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210023,China

ObjectiveTo explore the effect of Jisuikang on neural functional recovery,and expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)protein and mRNA level after spinal cord injury(SCI).Methods144 female Sprague-Dawley rats,weighted 180 to 220 g,were used for experiment.24 rats were randomly extracted into sham group(Group A),which had their vertebral plates and spines bitten away only.The others were randomly divided into model group(Group B),prednison group(Group C),and high,middle and low doses of Jisuikang group(Groups D to F)after SCI,24 rats in each group.Group C was given 0.06 g/(kg⋅d)prednison,and Groups D to F were given 50,25 and 12.5 g/(kg⋅d)Jisuikang respectively,which were given 20 ml/(kg⋅d)volume by intragastric administration.Groups A and B were given the same volume of normal saline(NS).The Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scores and oblique board test were applied to test the postoperative results 24 hours,3,7 and 14 days after SCI.The rats were executed and the spinal cord tissues were extracted 3,7 and 14 days after SCI.Immunohistochemistry,Western blotting and RQ-PCR were applied to test the expression of protein and mRNA of BDNF.ResultsBBB scores and angle of oblique board test were significantly lower in Groups B to F than in Group A 24 hours after SCI(P＜0.01).BBB scores were higher in both Groups C and E than in Group B 3 to 14 days after SCI(P＜0.05),and was significantly higher in Group E than in the other groups 14 days after SCI(P＜0.01).The results of immunohistochemistry and Western blotting showed that the protein expression of BDNF were significantly higher in Groups C and E than in Group B at different time points in the injured area after SCI(P＜0.01),while there was no significant difference between Groups C and E(P＞0.05).The results of RQ-PCR showed that prednisone and Jisuikang promoted the expression of BDNF mRNA.Group C(prednisone)had a most obvious effect at the beginning while Group E was better than Group C 14 days after SCI.ConclusionJisuikang can promote the neural functional recovery and the expression of BDNF on both protein andmRNAlevel in SCI rats.

spinal cord injury;Jisuikang;axonal regeneration;microenvironment;brain-derived neurotrophic factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.08.001

R651.2

A

1006-9771(2014)08-0701-08

2014-03-26

2014-04-28)

1.江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(No.CXZZ12_0609)；2.江苏省自然科学基金资助项目(No.BK2011180)。

1.南京中医药大学骨伤研究所，江苏南京市210023；2.南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏南京市210029。作者简介：郭杨(1985-)，男，江苏宿迁市人，博士研究生，主要研究方向：中医药防治骨关节病。通讯作者：黄桂成(1958-)，男，江苏仪征市人，教授，主任医师，博士研究生导师，主要研究方向：中医药治疗颈肩腰腿痛。E-mail:286745885@qq.com。

时间：2014-06-13 10:04

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3759.R.20140613.1004.001.html