碳纳米管丙氨瑞林对人子宫内膜癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长及对Smurf2表达的影响

王亚荣　张杏林　张三元

【摘要】 目的：观察碳纳米管丙氨瑞林对人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤组织中转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的泛素化调节因子2（Smurf2）表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法：以人子宫内膜癌Hec-1-B细胞株皮下移植瘤组织作为研究对象，分别给予生理盐水、碳纳米管、丙氨瑞林、碳纳米管丙氨瑞林，四种不同的干预方式，每6天1次，共5次。在干预过程中观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积，干预结束利用免疫组化法（PV）检测各肿瘤组织中Smurf2蛋白的表达。结果：碳纳米管丙氨瑞林组裸鼠精神饮食情况明显优于其他三组，体重明显轻于其他三组。取出移植瘤体后比较，碳纳米管丙氨瑞林组瘤体体积最小，与其他三组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。碳纳米管丙氨瑞林干预组瘤组织中Smurf2蛋白的表达较其他三组表达增多，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：丙氨瑞林可以抑制子宫内膜癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，在相同药物剂量条件下，碳纳米管丙氨瑞林作为缓释剂可以更好地增加裸鼠体重和抑制移植瘤组织的生长，有利于减少药物毒副作用，其作用机制可能是通过上调移植瘤组织中Smurf2蛋白来抑制肿瘤生长的。

【关键词】 碳纳米管； 丙氨瑞林； 子宫内膜癌； 移植瘤； Smurf2

Effect of CNTs-Alarelin on Human Endometrial Carcinoma in Nude Mice of Subcutaneous Xenograft and the Expression of Smurf2/WANG Ya-rong，ZHANG Xing-lin，ZHANG San-yuan.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：025-028

【Abstract】 Objective：To investigate the effects of CNTs-alarelin on human endometrial carcinoma in nude mice of subcutaneous xenograft by the expression of ubiquitin adjustment factor 2 （Smurf2） which inducting by the transforming growth factor β1（TGF-β1），and to explore its possible mechanism.Method：Human endometrial carcinoma models were established by subcutaneous transplantation in nude mice，and then 24 rats were randomly divided into 4 groups：control group，CNTs group，Alarelin group and CNTs-Alarelin group，respectively gave corresponding treatment，six days one time.Observed the systemic condition of the mice every day，measured the size of tumor.At end of the intervention，immunohistochemical method（PV） was used to detect various Smurf2 protein expression in tumor tissues.Result：The CNTs-Alarelin group was significantly better than the other groups，there were statistical significance（P<0.05）.It was the smallest volume that CNTs-Alarelin group，compared with other groups，and the differences were statistically significant（P<0.05）.Smurf2 protein expression in tumor tissue of CNTs-Alarelin group increased than the other three groups，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：CNTs-Alarelin can more effectively inhibit the growth of the human endometrial carcinoma in nude mice of subcutaneous xenograft.The mechanism may be related to increases Smurf2 protein.

【Key words】 Carbon nanotubes； Alarelin； Endometrial cancer； Xenografts； Smurf2

First-authors address：The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.009

丙氨瑞林是一种GnRH激动剂（GnRH-a），其生物活性是天然GnRH的15倍。持续使用GnRH-a可使垂体GnRHR被耗竭，抑制垂体功能，减少促性腺激素的分泌，从而使雌激素水平降至绝经期或略高于绝经期水平，因此他可以用于治疗激素依赖性肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等[1]。但对于其作用机制尚不明确。近年来研究发现，Smurf2是一种E3连接酶，由TGF-β1信号通路诱导的泛素化调节因子，对细胞周期的调控、肿瘤的浸润和转移、细胞衰老机制等方面具有重要作用[2]。碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs），是目前较先进的纳米粒子之一，是现代生物医学的研究热点，尤其是在药物载体方面[3-5]。本文通过比较GnRH类似物（丙氨瑞林）及其缓释剂型（碳纳米管丙氨瑞林）对人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响和Smurf2的表达高低，来探讨其作用机制，为临床上子宫内膜癌治疗提供实验基础及理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系和动物模型 人子宫内膜癌Hec-1-B细胞株（中国医学科学院基础医学研究所），24只BALB/C nu/nu裸鼠，5～6周龄，体重为16～20 g，雌性（国家噬齿类种子中心-中国药品生物制品检验所实验动物中心，许可证号：scxk（京）2009-0017），于无特定病原体（SPF，Specific pathogen free）环境饲养、提供。

1.2 主要药物和试剂 醋酸丙氨瑞林（alarelin acetate for injection）（上海静融生物科技有限公司）；碳纳米管、碳纳米管丙氨瑞林（太原理工大学新材料工程技术研究中心）；Smurf2免疫组化试剂盒（武汉博士德生物制品有限公司）。

1.3 细胞培养 根据胰消化培养法，人子宫内膜癌细胞株Hec-1B细胞采用高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL庆大霉素等），置于CO2培养箱中进行培养（含5%CO2、PH 7.2、环境温度为37 ℃）。消化、离心并收集处于对数期的Hec-1B细胞，制成终浓度为1.6×107/mL的单细胞Hec-1B悬液以备构建模型用。

1.4 裸鼠皮下移植瘤模型的制备及其生长状况检测 将24只荷瘤裸鼠（无特定病原体（SPF）环境下饲养）置于超净台内进行接种。碘酊局部皮肤消毒裸鼠左侧腋窝皮下，一次性无菌注射器抽取子宫内膜癌细胞株Hec-1-B细胞悬液0.5 mL（约含8.0×106个细胞），注射至裸鼠皮下。连续观察1周，待皮下成瘤直径达0.5 cm时，将24只裸鼠随机分为4组进行干预，每组6只，分别为生理盐水组（即对照组）、碳纳米管组、丙氨瑞林组（30 μg/kg）、碳纳米管丙氨瑞林组（碳纳米管的用量按丙氨瑞林剂量30 μg/kg折算），每只裸鼠每次肌肉注射0.4 mL，每6天1次，共5次，分笼饲养。实验期间每天观察裸鼠日常活动情况及移植瘤体的生长状况，种植后用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径a和短径b（每3天1次），计算肿瘤近似体积V（mm3）=（a×b2）/2。干预结束后处死裸鼠，完整称取瘤体。计算肿瘤抑瘤率=[（V对照组-V实验组）/V对照组]×100%。阳性标准为抑瘤率>15%。通过抑瘤率的比较来评估药物对移植瘤生长的抑制作用。

1.5 病理学检查 处死裸鼠后取新鲜瘤体，10%甲醛固定、石蜡包埋、HE染色，光镜观察肿瘤的病理变化。

1.6 免疫组化检测Smurf2蛋白表达 （1）处理石蜡切片：二甲苯、100% 酒精等处理切片，10 mmol/L柠檬酸溶液微波抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶；（2）滴加一抗（兔抗人Smurf2单克隆抗体工作液）、试剂1（Polymer Helper）、试剂2（Polyperoxidase-anti-mouse IgG）：37 ℃孵育，PBS冲洗；（3）DAB溶液显色、镜检，苏木素复染，酒精固定；（4）中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

学校病理科医师协助分析切片结果，Smurf2阳性细胞为胞浆出现棕黄色颗粒。（1）阳性细胞比例的判断：在400倍视野下，每例蜡块组织观察3个切片，阳性细胞所占的百分比判定：0分为阴性，1分为阳性细胞10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。（2）染色强度判断：按照分值来判定（0～3分），颜色强度依次为：无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色。（3）阳性等级的判断：每张切片的阳性细胞比例与染色强度的乘积，大于3分以上的结果为“+”。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，各均数间比较运用方差法进行分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及裸鼠生长状况的监测 裸鼠接种Hec-1B细胞悬液后，接种部位红肿、形成皮丘，一周后形成圆球状瘤体，并逐渐增大。随着移植瘤的不断增长，裸鼠开始出现不同程度的活动减少、食欲减退、体重下降等症状。不同干预组中肿瘤体积增长不同。

2.2 各组裸鼠移植瘤体积变化及对抑瘤率的影响 药物干预前，每组间体积比较差异均无统计学意义（P>0.05）。进行药物干预后，丙氨瑞组移植瘤体积和碳纳米管丙氨瑞林组分别为（1393±405）mm3、（1017±354）mm3，抑瘤率为40%、17.82%，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。分别与碳纳米管组和生理盐水组比较，差异也均有统计学意义（P<0.05），这说明碳纳米管丙氨瑞林对子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤有一定的抑制作用，且比丙氨瑞林对肿瘤的抑制作用更为显著。而碳纳米管组和生理盐水组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

3 讨论

碳纳米管（carbonnanotubes，CNTs）是纳米材料的一种，目前广泛应用于医学生物领域中，如制作疫苗、基因载体及药物载体等。其基本结构：两端分别用类似半个富勒烯分子的半球状封端，管体是由单层或复层六元碳环石墨层弯曲而成[6]。现用于药物载体的原始CNTs，有一定的毒副作用，其大小跟细胞对碳纳米管的摄取量的多少有关，而摄取量的多少又与碳纳米管尺寸和浓度有关[7]。Kayat等[8]认为，CNTs的毒性与多种因素相关，如结构、功能团、制备方法等。但经过化学修饰后可有效去除其在制备过程中残留的金属催化剂，从而降低其毒副作用。细胞可选择CNTs的长度和修饰基团，根据此特点，笔者可以将碳纳米管修饰成不同长度、不同基团修饰的各种型号，更适用于各种疾病的药物治疗。经过功能修饰后的CNTs降低其免疫原性，增加分散性、生物相容性、在血液中的循环时间、细胞穿透性等，同时可经肾脏代谢清除[9-13]，故可作为药物载体安全应用于临床。

研究表明，对于激素依赖性肿瘤可以持续性地给予GnRH-a治疗[14-15]。有学者认为，GnRH-a可直接影响子宫内膜上癌细胞的增殖及凋亡[16-18]。通过实验本课题组已证实GnRH-a（丙氨瑞林）可抑制人子宫内膜癌裸鼠移植瘤不断增长[19]。

目前，大多数研究是以化学药物作为支撑的负载药物，生物载体的研究并不多，并且缺乏激素类相关的抗肿瘤药物的缓慢释放剂制备的研究。为了实现药物的控释或缓释，提高疗效，降低毒副作用，关键是采用有效的药物载体。碳纳米管丙氨瑞林缓释剂，不仅可以延长丙氨瑞林对裸鼠移植瘤的作用时间，而且明显降低了高浓度药物对裸鼠的毒副作用，这种高效、低毒、靶向给药方式，使抗子宫内膜癌的激素药物丙氨瑞林的疗效更理想、更安全。

Smurf2在转化生长因子-β（TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等信号通路中具有重要的调控作用，在细胞周期的调控、肿瘤的浸润和转移、细胞衰老机制等方面都有重要的影响[7]。Smurf2是通过多种途径对TGF-β信号转导途径发挥负反馈调节作用[20]。本实验在碳纳米管丙氨瑞林对移植瘤抑制作用的基础上研究Smurf2的表达。

研究结果显示：（1）干预结束后，碳纳米管丙氨瑞林组的抑瘤率最大，且与其他三组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。丙氨瑞林组次之，与生理盐水组和碳纳米组比较差异有统计学意义（P<0.05）。说明碳纳米管丙氨瑞林和丙氨瑞林均可抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长，且相同剂量下，碳纳米管丙氨瑞林的抑瘤作用更显著。生理盐水组和碳纳米管组比较差异无统计学意义（P>0.05）。（2）碳纳米管丙氨瑞林组裸鼠体重较其他三组明显增加，且组间比较差异有统计学意义（P<0.05），显示碳纳米管丙氨瑞林可以更好地抑制肿瘤的生长，与等剂量的丙氨瑞林相比，不仅可以增加裸鼠体重，还可以改善其生存环境。生理盐水组与碳纳米管组裸鼠体重比较差异无统计学意义（P>0.05），表明功能化的碳纳米管对裸鼠几乎无毒副作用。（3）碳纳米管丙氨瑞组移植瘤组织中Smurf2的表达较其他三组表达明显增高，差异均有统计学意义（P<0.05），故认为碳纳米管丙氨瑞林可以抑制人子宫内膜癌细胞裸鼠移植瘤的生长，可能是通过上调Smurf2基因的表达来实现的。但因碳纳米管丙氨瑞林的抗肿瘤机制是多样化的，关于其具体作用机制、临床运用的最佳浓度及Smurf2的调控机制有待于进一步研究。

综上所述，与丙氨瑞林相比，碳纳米管丙氨瑞林缓释剂对子宫内膜癌的抑制作用更显著，要达到相同治疗效果，所用碳纳米管载体后，丙氨瑞林的用药总量将会大大下降，其药物副作用将会更少，它的抑制作用可能是与Smurf2基因的表达上调有关。本实验将为今后激素治疗子宫内膜癌提供一定的临床诊疗思路及理论依据，但该研究仍存在一些不足之处，未探讨碳纳米管丙氨瑞林的最佳用药剂量，今后可以选择不同的药物剂量对荷瘤裸鼠进行干预，来确定药物最佳剂量，进一步为临床诊疗提供理论依据。

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（收稿日期：2014-02-31） （本文编辑：欧丽）

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（收稿日期：2014-02-31） （本文编辑：欧丽）