漆酶催化苯甲醇氧化制备苯甲醛

刘长根，徐 飞，贾红华，周 华，韦 萍

(南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211800)

苯甲醛是一种重要的化工原料，广泛地应用于医药、农药、香料及染料等行业。生产苯甲醛的传统生产方法是采用苄叉二氯水解法［1］和甲苯氧化法［2］。其中，苄叉二氯水解法存在工艺流程长、产物分离困难、产品中含氯元素且排放出腐蚀性气体等不足，污染环境严重;甲苯氧化法是利用金属催化剂直接选择性氧化制备苯甲醛，虽然工艺过程简单，但产物产率较低。

漆酶在氧化反应中的应用研究较多，但主要偏重研究酚类、胺类和木质素类等［3-6］化合物的氧化，目前对醇类化合物的氧化研究较少，而且主要侧重于对氧化反应机制的研究［7-11］，专门针对苯甲醇的氧化研究偏少，尤其是对反应底物浓度(一般底物反应浓度为20 mmol/L，偏低)、氢受体种类及反应溶剂等反应工艺参数优化的研究更未见报道。

为此，笔者以自制的高活性漆酶为催化剂，研究苯甲醇催化氧化制备苯甲醛，通过氧化反应条件的优化研究，为苯甲醛的高效绿色合成奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

苯甲醇(分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司;2，2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)(98%)，东京化成工业株式会社;2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)(98%)，阿拉丁公司;无水1-羟基-苯并-三氮唑(HBT)(98%)，上海晶纯试剂有限公司;紫脲酸(VLA)(97%)，Fluka公司;其他试剂均为市售分析纯。

1.1.2 主要仪器

SP-6890型气相色谱仪(山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司)，HTZ-C-1台式冷冻恒温振荡器(太仓市实验设备厂)，PHS-3C型pH计(上海雷磁仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 漆酶的发酵及提取方法

以笔者所在实验室筛选的白腐菌Coriolus versicolor ZHH为菌种，经摇瓶发酵培养后得到含酶发酵液，离心去除菌体等固形物，加入(NH4)2SO4、离心获得沉淀，经冷冻干燥获得漆酶干粉，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 苯甲醇氧化反应方法

初始氧化反应条件:在25 mL的反应瓶中加入20 mmol/L苯甲醇溶液和40 U/mL漆酶，总反应体积为10 mL，30℃、通O20.5 h后密闭振荡反应24 h;反应结束后取样测定底物和产物浓度，计算反应转化率。

1.2.3 漆酶酶活的测定方法

以ABTS为底物，在420 nm条件下测定漆酶酶活，具体方法参照文献［12-13］。

1.2.4 底物与产物的检测方法

反应结束后转化液用二氯甲烷萃取3次，去除水相，含底物和产物的有机相直接利用气相色谱测定浓度。色谱柱为安捷伦DB-225毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm ×0.25 um)，具体分析方法参照文献［14］。

2 结果与讨论

2.1 介质体系对苯甲醇氧化反应的影响

2.1.1 介质体系的选择

漆酶的氧化还原电势较低，苯甲醇结构较稳定，必须借助电子传递介质能够完成反应。故在初始反应条件下，考察不同电子传递介质ABTS、HBT、VLA和TEMPO(10 mmol/L)对苯甲醇氧化反应的影响，结果见图1。

图1 介质体系对苯甲醛产率的影响ig.1 Effects of medium system of on yield of benzaldehyde

从图1可看出，介质TEMPO的加入对漆酶催化苯甲醇制备苯甲醛氧化反应的效率最高(58%)，故以下实验均加入TEMPO作为氧化反应介质体系。

2.1.2 TEMPO的用量对苯甲醛产率的影响

考察TEMPO的用量对苯甲醛产率的影响，结果见图2。由图2可知:当TEMPO与苯甲醇的质量摩尔比为1∶4时，苯甲醛的产率最高，达到71%。

图2 TEMPO与苯甲醇的摩尔浓度比对苯甲醛产率的影响Fig.2 Effects of TEMPO and benzene methanol molar concentration ratio on yield of benzaldehyde

2.2 底物浓度对氧化反应的影响

目前，漆酶氧化醇类化合物的研究中底物浓度一般选择为20 mmol/L，较低的底物及产物浓度必将给工艺放大与应用带来诸多麻烦，因此提高底物的反应浓度对于苯甲醛的酶法制备具有积极意义。在反应体系中考察不同底物浓度(20、40、60、80和100 mmol/L)，加入40 U/mL漆酶和上述浓度的TEMPO，30 ℃、通O20.5 h密闭振荡反应24 h，测定反应体系中苯甲醛的产率，结果见图3。

图3 苯甲醇浓度对苯甲醛产率的影响Fig.3 Effects of concentration of benzyl alcohol on yield of benzaldehyde

由图3可知:随着底物浓度的提高，氧化反应收率仍保持较高的水平，表明漆酶对高浓度底物有较好的耐受性，当底物苯甲醇的浓度为60 mmol/L，反应体系的苯甲醛产率最高，可达到76%。

2.3 漆酶用量对氧化反应的影响

为进一步提高氧化反应得率、降低漆酶用量，在上述优化实验基础上，在反应体系中采用不同漆酶用量(10、40、60、80、100 和 150 U/mL)进行氧化反应，测定苯甲醛的产率，结果见图4。

图4 漆酶用量对苯甲醛产率的影响Fig.4 Effects of concentration of laccase on yield of benzaldehyde

由图4可知:苯甲醛的产率并未随着漆酶用量的增加而增加，当反应体系中加入80 U/mL的漆酶时，苯甲醛的产率达到80%。

2.4 氢受体对氧化反应的影响

氢受体能够接受电子被还原，从而促进苯甲醇的氧化反应。在前面优化条件基础上，考察不同氢受体(丙酮、甲醛、戊二醛和乙醛)对苯甲醛产率的影响，结果见图5。由图5可知:丙酮作为氢受体效果最好。同时，考察不同丙酮浓度对苯甲醛产量的影响，结果见图6。由图6可知，当丙酮的加入量为60 mmol/L时，苯甲醛产率最高，达到89%。

图5 氢受体对苯甲醛产率的影响Fig.5 Effects of hydrogen acceptor on yield of benzaldehyde

图6 丙酮浓度对苯甲醛产率的影响Fig.6 Effects of acetone concentration on yield of benzaldehyde

2.5 助溶剂对氧化反应的影响

由于产物苯甲醛不溶于水，反应体系中加入少量有机溶剂可以促进苯甲醛向有机相的转移，推动反应向产物方向进行，提高产物的转化得率。在上述优化实验条件基础上，考察不同有机溶剂(丁二酸二甲酯、环氧己烷、四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯和正丁酸，0.5 mol/L)对氧化反应的影响，结果见图7。由图7可知:助溶剂的加入对苯甲醛的收率提高没有促进作用，结合下游产物分离成本，故反应中不考虑添加助溶剂。

2.6 通氧方式对反应的影响

O2是氧化反应的必要因素，由于O2在反应溶液中溶解度较低，故不同的供氧方式影响氧化反应的得率。在上述优化实验的基础上，通O20.5 h后，再考察不同通氧方式(密封、敞开和连续通氧等)对氧化反应的影响，结果见图8。

由图8知:通O20.5 h后密闭反应时，苯甲醛的产率最高，达94%。敞开反应时，苯甲醛的产率最低。这可能是氧化反应需要一定量O2的参与，但过高的O2浓度对酶会产生中毒作用、导致反应率下降。

图7 助溶剂对苯甲醛产率的影响Fig.7 Effects of different solvent system on yield of benzaldehyde

图8 供氧方式对苯甲醛产率的影响Fig.8 Effect of oxygen supply mode on yield of benzaldehyde

同时考察反应时间对苯甲醛产率的影响，发现反应36 h苯甲醛的最高产率为98%(图9)。

图9 反应时间对苯甲醛产率的影响ig.9 Effects of reaction time of on yield of benzaldehyde

3 结论

以自制的高活性漆酶为催化剂，开展了漆酶催化苯甲醇制备苯甲醛的合成工艺优化研究。经过优化得到的最佳工艺条件为以80 U/mL的漆酶为催化剂，在柠檬酸/柠檬酸钠反应体系中，以 TEPMO为介质体系(TEMPO与底物苯甲醇的最佳摩尔浓度比为1∶4)、60 mmol/L的丙酮为氢受体，60 mmol/L的苯甲醇在通O20.5 h后密闭反应36 h，最终苯甲醛的产率达98%，为酶法制备苯甲醛的工艺放大与应用奠定了良好基础。

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