乳酸钠、茶多酚与壳聚糖协同抑制铜绿假单胞菌的效果

姚 远，董庆利，叶 维，胡孟晗

(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093)

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是导致肉类腐败的优势菌之一［1］，同时又是条件致病菌，常引起皮肤黏膜的感染，如角膜溃疡、外耳道炎，感染伤口形成绿色脓液等［2］。因此，研究天然防腐剂对铜绿假单胞菌的抑制作用在肉类保鲜上具有现实意义。

乳酸钠、茶多酚和壳聚糖是当前研究较多的天然食品防腐剂。熊成等［3］研究了乳酸钠对铜绿假单胞菌的特定抑制作用。姚远等［4］从乳酸钠影响细胞膜的功能结构完整性和胞内ATP合成两方面研究了乳酸钠抑制铜绿假单胞菌生长的机制。孙京新等［5］以假单胞菌为研究对象，结果显示茶多酚对假单胞菌有很强的抑菌作用。Yan等［6］研究了壳聚糖对金黄色葡萄球菌和假单胞菌细胞膜渗透性的影响，研究表明壳聚糖能增加金黄色葡萄球菌和假单胞菌细胞膜的渗透性，从而杀死细菌。

根据栅栏技术的原理［7］，将不同种类的防腐剂综合运用，发挥其协同效应，不仅可以增强其抑菌效果，而且可以降低单一防腐剂的使用量，从而减少其对食品品质的影响，提高其应用的安全性。如杨胜平等［8］将1.0%壳聚糖与0.4%茶多酚对带鱼进行复配涂膜保鲜，显著延长了带鱼的保鲜期。徐世明等［9］运用响应面法复配出Nisin、乳酸钠和山梨酸钾最优组合，显著延长了烧鸡货架期。Yu［10］利用响应面法对Nisin、茶多酚和壳聚糖进行复配组合，应用于冷却羊肉中，研究其交互作用，确定复合保鲜剂最佳配比。

基于笔者所在课题组前期对乳酸钠抑菌效果的研究［3－4］，其是否与茶多酚和壳聚糖复配后对铜绿假单胞菌具有协同抑制效果有待明确，本试验通过常量肉汤稀释法和琼脂扩散法测定乳酸钠、茶多酚和壳聚糖在培养基中对铜绿假单胞菌的抑制效果，并进行协同抑菌实验，确定3种防腐剂抑制铜绿假单胞菌的最优配比，为实际食品中防腐剂优选提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与设备

1.1.1 菌株来源及菌悬液制备

铜绿假单胞菌分离自市售冷鲜猪肉中，实验时进行平板划线，在27℃下活化3次，选择性培养基的配制参照文献［11］。取一环菌苔接种于300 mL的营养肉汤培养基中培养12～18 h使菌密度达到8lg(个/mL)，经无菌生理盐水分别稀释制得5lg(个/mL)和4lg(个/mL)的菌悬液备用［12］。

1.1.2 主要试剂

茶多酚(纯度≥98%)，上海融禾医药科技发展有限公司;壳聚糖(脱乙酰度92.2%)、乳酸钠(纯度53.4%)，上海国药化学集团有限公司。

1.1.3 设备

YXQ-LS-SⅡ型全自动立式电热压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);SW-CJ-2FD型无菌操作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);HWS-150型恒温恒湿培养箱(上海比朗仪器有限公司);PHS-25型pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的测定

MIC被定义为在特定环境下孵育24 h，可抑制铜绿假单胞菌分别出现明显增长的最低乳酸钠、壳聚糖和茶多酚的浓度［13］。利用二倍稀释法配制成不同浓度的防腐剂溶液，在每管内加入前述5lg(个/mL)菌悬液各1 mL、37℃培养24 h，通过肉眼观察无细菌生长的防腐剂浓度，即为此种防腐剂的MIC。

1.2.2 单一防腐剂对铜绿假单胞菌的抑制作用

利用琼脂扩散法测定乳酸钠、茶多酚、壳聚糖的抗菌活力［14］。移取前述4lg(个/mL)的铜绿假单胞菌悬液100 μL均匀涂布在培养基上，应用二倍稀释法稀释3种防腐剂溶液(乳酸钠0.5～250 mg/mL、茶多酚 0.10～50 mg/mL、壳聚糖0.013～6.25 mg/mL)，并分别移取200 μL的防腐剂置于琼脂平板上的牛津杯中(不锈钢柱体:外径(7.8±0.1)mm、内径(6.0±0.1)mm、高 10.00 mm)。37℃培养24 h后用游标卡尺测量各抑菌圈的大小(直径mm)。

1.2.3 复合防腐剂配比的确定

采用 Design-Expert 8.0.5b软件中的 Box-Behnken试验设计(表1)，根据1.2.2的测定结果确定防腐剂浓度，对防腐剂的抑菌效果进行响应面优化，考察乳酸钠、茶多酚和壳聚糖的复合防腐效果。应用逐步回归方法(引入水平为0.05，去除水平为0.10)建立抑菌圈对因素乳酸钠、茶多酚和壳聚糖的响应曲面模型。

1.2.4 响应曲面法(response surface methodology，RSM)线性回归方程的验证

获得显著的多元回归方程后，在设定的实验条件范围内(乳酸钠 31.7～62.5 mg/mL、茶多酚6.25～12.5 mg/mL、壳聚糖1.58～3.17 mg/mL)设置10组随机数据组合，再随机选取5组数据进行组合，按上述方法代入线性回归方程，计算抑菌圈。

表1 Box-Behnken试验分析因素与水平设计表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 结果与讨论

2.1 乳酸钠、茶多酚和壳聚糖最小抑菌浓度的确定

通过实验发现:3种防腐剂的最小抑菌浓度(MIC)分别为茶多酚 0.79 mg/mL，乳酸钠4.00 mg/mL和壳聚糖0.40 mg/mL。本文的茶多酚MIC略高于刘书亮等［15］的研究结果，其原因可能是茶多酚的纯度，抑菌方法、培养基等不同所致。壳聚糖MIC与刘书亮等［15］报道也有所差异，其原因除试验方法不同外，还可能与壳聚糖的脱乙酰度、相对分子质量大小等有关［16］。

2.2 乳酸钠、茶多酚和壳聚糖对铜绿假单胞菌的抑制作用

比较3种防腐剂的抑菌效果，结果见图1。由图1可知:乳酸钠的抑菌效果最明显，茶多酚次之，壳聚糖最差。而3种抑菌剂随着浓度的增加，抑菌效果均明显增强，其中以乳酸钠最为明显。因此，选择乳酸钠的质量浓度为31.70、47.10和62.50 mg/mL，茶多酚的质量浓度为6.25、9.38和12.50 mg/mL，壳聚糖的质量浓度为1.58、2.38和3.17 mg/mL，进行响应面实验(表1)。

2.3 3种抑菌剂在培养基中复合使用的抑菌效果

乳酸钠是一种弱有机酸，其非解离成分在保鲜中起主要作用，低pH有利于NaL解离平衡向乳酸分子形成方向移动，提高乳酸分子浓度，从而影响细菌生长［17］。笔者将乳酸钠溶液的pH调至4.0左右，一方面在3种防腐剂复配后不会较大程度的改变pH，同时也会增强乳酸钠的抑菌效果。茶多酚和壳聚糖是当前研究较多的天然食品防腐剂，采用响应面法(Box-Behnken的中心组合设计)，研究乳酸钠和茶多酚、壳聚糖复配后对铜绿假单胞菌的抑制效果，并对三者的最佳配比组合进行优化，响应曲面试验结果见表2。

图1 乳酸钠、茶多酚和壳聚糖对在培养基中铜绿假单胞菌的抑菌效果Fig.1 Effects of sodium lactate，tea polyphenols，and chitosan on the autibacterial activities of P.aeruginosa in culture medium

建立抑菌圈(Y)对A、B、C的响应曲面模型，见式(1)。

对构建的模型方差分析表明，所得的Y回归方程高度显著(P=0.0002)，且失拟检验不显著(P=0.15)。从模型方差分析结果(表3)可以看出乳酸钠对抑菌圈的影响，A的一次项效应、二次项效应以及与B和C交互效应显著;B只有和A的交互效应对抑菌圈大小影响显著;C的一次项以及和A的交互项对抑菌圈影响显著。

表2 Box-Behnken响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

乳酸钠分别与茶多酚和壳聚糖对抑菌圈影响结果见图2。由图2可知:等高线曲率比较小，形状近似椭圆，说明乳酸钠和茶多酚、壳聚糖的相交影响显著。当乳酸钠含量趋近62.50 mg/mL时，随着茶多酚含量的增加，抑菌圈逐渐减小，说明乳酸钠和茶多酚之间存在明显的拮抗作用;当乳酸钠含量趋近62.50 mg/mL时，随着壳聚糖含量的增加，抑菌圈逐渐增大，说明乳酸钠和壳聚糖之间存在明显的协同作用;国内外对乳酸钠和茶多酚、壳聚糖之间的交互作用研究较少，本实验得出，当乳酸钠达到一定浓度，茶多酚和乳酸钠之间存在明显的拮抗作用，姚远等［4］研究了乳酸钠抑制铜绿假单胞菌生长的机制，认为一定浓度的乳酸钠会影响铜绿假单胞菌细胞膜(壁)结构完整性和胞内ATP的合成，从而抑制铜绿假单胞菌的生长;Yi等［18］认为用茶多酚处理铜绿假单胞菌过后，菌的细胞膜渗透性会增加，从而释放一些小分子物质来瓦解细胞。当二者共同作用于铜绿假单胞菌时，可能存在竞争现象，从而导致二种防腐剂共同作用时会产生拮抗作用。茶多酚和壳聚糖之间交互作用不显著，与Yu等［10］研究的一致。

表3 RSM模型系数显著性检验表Table 3 Significance test of RSM model

图2 乳酸钠+茶多酚及乳酸钠+壳聚糖对抑菌圈影响的响应面图Fig.2 Response surface for inhibition zones of sodium lactate+tea polyphends and sodium lactate+chitosan

由以上分析可得，在实际应用中，应使乳酸钠和壳聚糖的浓度保持在最高浓度，即乳酸钠取62.50 mg/mL，壳聚糖取3.17 mg/mL，抑菌圈达到最大，抑菌效果最好。

2.4 RSM线性回归方程的验证

应用建立的RSM线性回归预测方程分别对建模的10组处理(表4)和验证的5组处理(表5)进行验证，结果显示，此线性回归预测方程可靠性较高，能够较好的预测在本实验条件下不同浓度的乳酸钠、茶多酚、壳聚糖复配后对铜绿假单胞菌抑制效果，证明该模型预测值与实测值吻合较好［19］。

表4 不同浓度的乳酸钠、茶多酚和壳聚糖复配对铜绿假单胞菌抑菌圈的观测值和预测值Table 4 Observed and predicted inhibition zones toward P.aeruginosa by RSM on different concentrations of combined sodium lactate，tea polyphenols and chitosan

表5 乳酸钠、茶多酚和壳聚糖复配用于验证对铜绿假单胞菌抑菌圈的观测值和预测值Table 5 Observed and predicted inhibition zones toward P.aeruginosa by RSM for validation on different concentrations of combined sodium lactate，tea polyphenols and chitosan

当茶多酚不添加时，乳酸钠和壳聚糖取最大浓度时，预测结果和实际结果相差较大，可能是因为实验中测量误差较大。

3 结论

从建立的RSM的预测模型来看，乳酸钠对铜绿假单胞菌的抑制效果最好，其次是壳聚糖和茶多酚，将3种防腐剂复配后，当乳酸钠达到62.50 mg/mL时，乳酸钠和茶多酚之间存在明显的拮抗作用，乳酸钠和壳聚糖之间存在明显的协同作用，当乳酸钠为62.50 mg/mL，壳聚糖为3.17 mg/mL，茶多酚不添加时，复合保鲜剂的抑菌效果最好，并且验证实验中模型预测值与实测值吻合较好。

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