D-乳酸高产菌菊糖芽胞乳杆菌Y2-8磷酸果糖激酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

郑 璐，柏中中，许婷婷，何冰芳

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211800;2.南京中医药大学 基础医学院，南京 210046)

D-乳酸是一种重要的手性中间体，已被用于多种手性物质的合成。近年来高光学纯度的D-乳酸因为其在合成耐热性更高、机械强度更好的聚乳酸材料方面的实际应用极大地带动了D-乳酸的生产研究［1］。微生物发酵法生产D-乳酸，不仅可以解决传统化学合成法成本高、分离困难等问题，还可以摆脱对石化资源的依赖，减少环境污染［2］。菊糖芽胞乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)是典型的同型发酵D-乳酸的优势菌株，适合大规模生产高纯度的D-乳酸。国内外许多学者对该菌株的菌种改良做了大量研究，取得了一定可喜的成效，但这些研究主要通过诱变筛选结合发酵工艺的优化来获得高产突变株，存在易退化和生产强度低等缺陷［3－4］。因此，这就需要对该菌株在分子水平上进行解析，进而通过基因工程改造使之更适合于工业化生产的要求。

磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK，EC 2.7.1.11)是糖酵解途径中的限速变构调控酶，以ATP作为磷酸基供体催化6-磷酸果糖(F-6-P)的磷酸化［5］。笔者所在课题组的前期研究发现，S.inulinus糖酵解代谢流和D-乳酸产量提高的同时，PFK酶活也显著提高［3，6］。Andersen 等［7］发现乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)PFK酶活的降低将直接导致生长速率和糖酵解代谢流的强烈抑制。但是，关于S.inulinus PFK是如何调控糖酵解和D-乳酸生产还未见报道。PFK对糖酵解代谢流有重要调控作用，通常不同生物来源的PFK有不同的变构调控性质［5］。一般细菌来源的PFK是相对分子质量为3.5×104左右的同源四聚体，ADP或GDP通过提高酶对底物F-6-P的亲和力激活该酶，同时磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)对该酶具有显著的抑制作用［8］。

本研究中笔者克隆S.inulinus Y2-8的pfk基因，并在大肠杆菌进行异源表达，考察重组菌的PFK比酶活变化，以期为后续对该酶进行纯化和变构调控机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

质粒pSE380和大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)由笔者所在实验室保存;Sporolactobacillus inulinus Y2-8 CCTCC 208052为笔者所在实验室研究人员自行筛选获得的D-乳酸高产菌。

1.1.2 主要试剂

pfu酶购自Fermentas公司，限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司，小量胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司，PCR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，ATP、ADP、F-6-P、NADH、醛缩酶(aldolase)、丙糖磷酸异构酶(triosephosphate isomerase)、α-甘油磷酸脱氢酶(αglycerophosphate dehydrogenase)均购自Sigma公司，其余常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

1.1.3 培养基及培养条件

LB培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母膏 5、NaCl 10。重组大肠杆菌添加氨苄青霉素至终质量浓度为100 μg/mL。

平板培养基(g/L):葡萄糖20、酵母膏2、蛋白胨 2、KH2PO41、Na2Ac 2、MgSO40.2、琼脂粉 20;玉米浆 2 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取和pfk基因的克隆

将S.inulinus Y2-8接种于37℃厌氧培养48 h，收集菌体，基因组 DNA的提取采用酚-氯仿抽提法［9］。

以S.inulinus Y2-8基因组DNA为模板，依据本课题组前期克隆获得的Sporolactobacillus sp.DX12的PFK基因(pfk)序列(NCBI登录号EU878300)设计引物如下(下划线代表酶切位点):正向5'-GCGCCATGGGCAAAAAAATTGGAGTTCTG-3'(包含NcoⅠ位点)，反向5'-GCCCTCGAGTTATATGGATAATACTT-3'(包含XhoⅠ位点)，利用PCR扩增pfk基因。PCR扩增条件:95℃预变性5 min;94℃变性30 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min 20 s，30个循环;72℃ 延伸5 min，冷却至4℃。

1.2.2 pfk基因的生物信息学分析

从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中选择9种不同来源的典型乳酸菌的PFK序列，采用 Clustal X(version 1.8)，将 S.inulinus Y2-8的PFK序列与其他9种来源的PFK序列进行比对，考察其底物结合位点和变构调控位点。序列相似性比较采用 NCBI的 BLAST软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.2.3 重组表达质粒的构建

将PCR产物经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后与进行相同酶切的质粒 pSE380相连，构建重组质粒pSE-pfk。通过 CaCl2法将重组质粒转化入 E.coli BL21中［9］。阳性重组子采用菌落PCR和提取质粒双酶切鉴定，并进行测序(英潍捷基(上海)贸易有限公司)。

1.2.4 PFK在大肠杆菌中的表达

将重组菌接种到LB液体培养基中过夜培养，以1%(体积分数)的接种量接种至新鲜培养基中，培养至OD600到0.6～0.8时，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在不同温度下诱导不同的时间。菌液离心(4℃、12 000 g、10 min)，菌泥用缓冲液 (50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2，pH 7.5)洗涤2遍后重悬，在冰浴中超声破碎(300 W、超声3 s、间歇 5 s，总共5 min)，4 ℃、12 000 g 离心15 min去除细胞碎片，得到粗酶液。

1.2.5 SDS-PAGE电泳和蛋白含量分析

取粗酶液进行SDS-PAGE分析，并以未诱导的E-pSE-pfk及E.coli-pSE作为对照。蛋白质含量测定采用Bradford法［10］，以牛血清白BSA为标准品，测定利用Bradford蛋白定量试剂盒(TIANGEN公司)。

1.2.6 PFK酶活性测定

PFK酶活采用酶耦联法测定［8］。粗酶液(5 μL)加入250 μL 反应体系(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液、pH 8.5，5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L NADH，1 mmol/L ATP、5 mmol/L F-6-P、4 U/mL 醛缩酶、丙糖磷酸异构酶和α-甘油磷酸脱氢酶)中启动反应。30℃平衡3 min后，测定340 nm处NADH吸光值的变化。PFK酶活定义为在30℃下每分钟生成1.0 μmol 1，6-二磷酸果糖所需要的酶量。PFK比酶活为每毫克粗酶液蛋白质的酶活。

2 结果与讨论

2.1 S.inulinus Y2-8 pfk基因的克隆及表达载体的构建

以S.inulinus Y2-8基因组为模板，扩增pfk基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测在960 bp左右有一明显条带(图1(a))，与预计结果一致。构建重组质粒，经过抗性筛选和双酶切验证，结果显示(图1(b))重组质粒在960 bp左右比空载体pSE380多出一条带，与插入的外源基因pfk大小一致，表明成功获得重组质粒pSE-pfk，重组菌命名为E-pSE-pfk。

2.2 S.inulinus Y2-8 pfk基因的生物信息学分析

测序分析表明，Y2-8的pfk为960 bp，编码319个氨基酸。将该DNA序列提交GenBank，所得登录号为KC415135。序列比对分析表明，Y2-8的pfk的核苷酸序列与来源于S.inulunus CASD基因组推测的pfk基因(ZP_09714106)的核苷酸序列相似性为100%。BLAST比对显示，S.inulinus Y2-8的PFK氨基酸序列与来源于Geobacillus stearothermophilus的PFK(BAA02405)具有最高的相似性，为 71%［11］，与其他来源的芽胞杆菌属的PFK均具有较高的氨基酸相似度(71% ～67%)［8］。

图1 S.inulinus Y2-8 pfk的PCR扩增产物及重组质粒的双酶切验证电泳图谱Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product of pfk gene from S.inulinus Y2-8 and enzymatic result of recombinant plasmids

将S.inulinus Y2-8 PFK与9种不同来源典型乳酸菌PFK的氨基酸序列进行比对，分析其活性位点(图2)。由图2可知:S.inulinus Y2-8 PFK与其他乳酸菌的PFK均具有较高的氨基酸相似性(55%～71%)。根据来源于 G.stearothermophilus和Lactobacillus bulgaricus PFK 的活性位点［8］，可以发现，不同来源PFK的底物F-6-P和MgATP的结合位点是严格保守的。但是，不同乳酸菌PFK的变构效应物结合位点存在着一定的差异，如来源于芽胞杆菌属PFK的E187和R211在L.bulgaricus PFK突变成D187和S211，而这很可能造成变构效应的差异。酶动力学和晶体结构解析表明，L.bulgaricus PFK对变构效应物MgADP和PEP的亲和力明显低于G.stearothermophilus PFK。S.inulinus Y2-8 PFK的变构效应物结合位点与来源于芽胞杆菌属PFK具有很高的保守性，可以预测，两者的变构效应具有很大的相似性。但是S.inulinus是一种古老的细菌，有着较为保守的进化过程。笔者前期在对葡萄糖磷酸化关键酶葡萄糖激酶(GLK)的研究中发现，虽然该GLK与来源芽胞杆菌属GLK具有严格保守的活性位点，但是S.inulinus的GLK具有与众不同的广泛底物特异性［12］。因此，对S.inulinus PFK变构效应机制的细致解析，将是笔者下一阶段的工作目标之一。

图2 S.inulinus PFK与9种不同来源乳酸菌的PFK的氨基酸序列比对结果Fig.2 Alignment of amino acid sequences of PFK from S.inulinus with those from different lactic acid bacteria

2.3 PFK在重组菌E-pSE-pfk中的诱导表达

重组菌E-pSE-pfk在加入0.5 mmol/L IPTG后在30℃诱导表达6 h，超声破碎上清液的PFK比酶活为1.02 U/mg，而空宿主的比酶活为0.16 U/mg，SDSPAGE电泳分析结果见图3。由图3可知:重组菌在3.4×104左右处有明显的条带，与理论计算的相对分子质量3.438×104一致，而含pSE380空质粒对照菌株中未见明显条带。这说明，S.inulinus pfk在E.coli中得到了成功表达。但是由于包涵体的存在导致可溶性蛋白含量较低，PFK比酶活较低，因此，需要对诱导条件进行优化。

2.4 重组菌诱导条件的优化

2.4.1 诱导温度的影响

按照1.2.4接种重组菌 E-pSE-pfk，加入0.5 mmol/L IPTG后诱导6 h，考察温度对重组菌的影响，结果见图4。由图4可知:随着温度的降低，PFK比酶活反而在逐渐升高，在20℃条件下诱导PFK比酶活有大幅度提高，达到最高值3.72 U/mg。SDS-PAGE分析也表明，随着温度的降低，可溶性的PFK蛋白含量在明显增高。但是，当温度低于20℃时，蛋白含量和PFK比酶活反而降低。

2.4.2 IPTG诱导剂浓度的影响

按照1.2.4接种重组菌E-pSE-pfk，20℃诱导6 h，考察不同IPTG浓度对重组菌的影响，结果见图5。由图5可知:随着IPTG浓度的升高，PFK比酶活显著提高，在0.1 mmol/L IPTG时，重组菌PFK比酶活达到最高值，4.31 U/mg。但是当IPTG浓度大于0.1 mmol/L，PFK比酶活反而有所下降。

2.4.3 IPTG诱导时间的影响

按照1.2.4接种重组菌E-pSE-pfk，加入0.1 mmol/L IPTG，20℃时诱导，考察不同诱导时间对重组菌产酶的影响，结果见图6。由图6可知:随着时间的延长，PFK比酶活随之升高，在诱导12 h后，PFK比酶活达到最高，为4.89 U/mg。但是，当诱导时间超过12 h，PFK酶活有所降低。这有可能是由于细胞已经进入衰亡期，发酵液里存在一些使表达的重组蛋白降解的因素，导致酶活力下降。

3 SDS-PAGE分析不同诱导温度下重组菌的PFK表达Fig.3 SDS-PAGE analysis of PFK expression levels of recombinant stain induced at different temperatures

图4 诱导温度对重组菌PFK比酶活的影响Fig.4 Effects of temperature on PFK specific activity of recombinant stain

图5 IPTG对重组菌PFK比酶活的影响Fig.5 Effects of IPTG concentration on PFK specific activity of recombinant stain

图6 诱导时间对重组菌PFK比酶活的影响Fig.6 Effects of induction time on PFK specific activity of recombinant stain

大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统，而实现外源基因的高效表达，宿主与载体以及诱导方法的选择至关重要［13］。笔者在前期采用pET系统进行表达时，目的蛋白受T7强启动子控制而过量表达，不能自发折叠卷曲，形成了不具生物活性的包涵体［13］。pSE380是也是常用的表达载体，其启动子Ptrc表达活性虽强，但是不容易形成包涵体，对保持酶活力非常有利［14］。在今后的研究中，可以采用带组氨酸标签的pSE380表达载体，方便进行镍柱亲和层析纯化而获得电泳纯的目的蛋白。

经诱导条件的优化，重组菌E-pSE-pfk在加入0.1 mmol/L IPTG后，在20℃诱导12 h，粗酶液的PFK比酶活可达4.89 U/mg，比优化前提高了4.79倍，为后续的蛋白纯化以及活性研究奠定了实验基础。优化结果表明，诱导温度、IPTG浓度和诱导时间都对比酶活有一定的影响，其中诱导温度对可溶性酶表达量的影响最大。低温条件极大地增加了可溶性活性蛋白的含量，这可能是由于低温能降低蛋白质合成的速率，改变蛋白质折叠的动力学，从而导致正确折叠的蛋白增加［13］。

3 结论

以D-乳酸高产菌S.inulinus Y2-8基因组DNA为模板，获得磷酸果糖激酶基因，通过与不同来源乳酸菌PFK氨基酸序列的比对，表明其具有保守的底物结合位点和不同的效应物结合位点。进一步通过pSE380表达系统和低温诱导实现来源于S.inulinus的PFK在大肠杆菌中的可溶性异源表达。诱导条件优化后，重组菌PFK的比酶活可达4.89 U/mg，为进一步研究其变构调控性质和高产基因工程菌的构建提供了实验基础。

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