褐苞蒿挥发油成分及其抗菌活性研究

周金沙 朱 良 李 乐 钟菲菲 李 林

ZHOU Jin－sha 1 ZHU Liang 2 LI Le 1 ZHONG Fei－fei 1 LI Lin 1

（1.湖南省食品安全生产工程技术研究中心，湖南 长沙 410008；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510641）

（1.Food Safety Production Engineering Technology Research Center of Hunan Province，Changshan，Hunan 410013，China；2.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong 510641，China）

蒿属植物（Artemisia L.）是菊科植物中规模最大，分布最广的属，包括超过500种植物，在地理上分布在欧洲、北美、亚洲和南非的温带地区。在中国分布的约有180余种和44个变种［1］。许多种蒿属植物是传统的中国药用植物，自古以来就用来治疗各种疾病，例如疟疾、肝炎、利尿、高血压、过敏、青紫、黄疸、癌症、炎症以及由微生物引起的感染等［2］。

褐苞蒿（Artemisia phaeolepis Krasch.）是菊科蒿属的多年生草本植物。主要分布在中国大陆的新疆、内蒙古、西藏、青海、宁夏、甘肃、山西以及俄罗斯、蒙古等地，生长于海拔2 500～3 600 m的地区，一般生长在沟谷、路旁、草地、山坡、林缘灌丛等地区、荒滩、草甸和砾质皮地与半荒漠草原地区。褐苞蒿具有很强的挥发性气味，在传统的藏药中，这种草药用来治疗感冒和黄疸型肝炎［3］。目前，国内外关于该植物挥发油的研究未见报道，鉴于该植物富含挥发油的特点及原植物全草香气浓郁，利用水蒸气蒸馏方法提取褐苞蒿中的挥发油，对其挥发油进行了分析，并对挥发油抑菌生物活性进行研究，以期为褐苞蒿进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

褐苞蒿全草：于2011年9月收集于中国山西省五台山。

1.1.2 主要仪器

GC—MS联用仪：HP－6890／5973型，美国惠普公司；

高压灭菌锅：YXQ－LS－100型，上海涵今仪器仪表有限公司；

电热恒温培养箱：DHP－9032型，上海一恒科技有限公司；

超净操作台：ATF－1340型，深圳市爱腾来净化科技公司；

显微镜：13395HZX型，上海莱卡显微镜系统有限公司。

1.1.3 主要试剂

所用试剂：均为分析纯，市售。

1.1.4 供试菌株

大肠埃希氏菌CCTCC AB91112、枯草芽孢杆菌CCTCC AB92068、金黄色葡萄球菌CCTCC AB91053、酿酒酵母CCTCC AY92042和毛霉 CCTCC AF 93209：中国中心菌种保藏中心（CCTCC）。

1.2 试验方法

1.2.1 精油提取 将褐苞蒿干草粉碎后，称取1 000 g，装入5 000 mL圆底烧瓶中，加入3 500 mL蒸馏水，浸泡12 h后，按2010年版《中华人民共和国药典》中方法［4］，采用水蒸气蒸馏法提取6 h，得到7.6 g具有特殊气味的淡黄色油状液体，出油率为0.76%所得到的油用无水硫酸钠干燥24 h，过滤，然后在4℃下保存在密封的棕色玻璃瓶中，直到进行测试。

1.2.2 气相色谱条件 色谱柱为 HP－5 MS毛细管柱（30 m ×0.25 mm i.d.，0.25μm）；程序升温：从40℃保持1 min，以3℃／min升到250℃，然后保持在250℃下20 min。进样口温度为250℃；载气为 He；柱流量为1 m L／min；进样量为0.5μL。

1.2.3 质谱条件 离子源；电离电压为70 eV；离子源温度为230℃，GC—MS接口温度为260℃；扫描范围20～450 Amu。

1.2.4 GC／MS分析条件及成分解析 保留指数RI测定方法是使用C6～C26正构烷烃标样，与精油样品同样条件下进行GC／MS分析。成分解析时，采用标准质谱数据库 Wiley（V.7.0）与 NIST （V.2.0）进行保留指数 RI核实与标准谱图对照。成分相对含量采用峰面积归一化法计算。

1.2.5 生物活性测定

（1）培养基的配制：细菌培养基是使用 Muller－Hinton肉汤，按照常规方法制备，灭菌待用；酵母和霉菌培养基是沙氏葡萄糖琼脂培养基，按照常规方法制备，灭菌待用。所有菌株均在4℃下保存，使用时，细菌菌株于37℃在Muller－Hinton肉汤中培养24 h；酵母菌株于28℃在沙氏葡萄糖琼脂中培养48 h；真菌菌株于28℃在沙氏葡萄糖琼脂中培养120 h。

（2）圆盘扩散法：根据文献［5］。培养皿中置入20 m L融化并冷却到45～55℃的培养基，待其凝固成平面后，用移液器吸取0.1 mL制备好的液体菌悬液注入其中并涂布均匀。取灭菌滤纸片（直径6.0 mm）放置于培养皿中央，用移液器吸取1 000μg的精油注入到滤纸片的正中央后，细菌于37℃培养24 h，酵母于28℃培养48 h，真菌于28℃培养120 h测定抑菌圈直径。取10μg链霉素作对照。

（3）最低抑制浓度法（MIC）：根据文献［6］。精油的MIC值通过肉汤稀释法测定。在试管中用培养基制备浓度从0.25～1 000μg／m L的精油稀释液，再加入0.5 m L供试菌菌悬液。细菌于37℃培养24 h，酵母于28℃培养48 h，真菌于28℃培养120 h测定。

（4）统计分析：所有试验进行了3次平行试验，并且结果被计算为平均值 ± 标准差。

2 结果与分析

2.1 褐苞蒿精油化学成分分析

褐苞蒿精油经GC／MS条件分离得到85个组分，结果见图1。用面积归一化方法测定了各峰面积，经计算机质谱数据库检索，鉴定了其中65个化合物，占总峰面积的92.7%，分析鉴定结果见表1。由表1可知，褐苞蒿精油中的主要成分为桉油醇（11.30%），樟脑（8.21%），4－萜烯醇（7.32%），石竹烯氧化物（6.34%），大根香叶烯 D（6.39%）和石竹烯（5.37%）。

图1 褐苞蒿精油的GC—MS的总离子流图Figure 1 Total ion current chromatogram of the essential oil from A.Phaeolepis

表1 褐苞蒿精油的化学成分及含量Table 1 Chemical composition of the essential oil from A.phaeolepis

表1 褐苞蒿精油的化学成分及含量Table 1 Chemical composition of the essential oil from A.phaeolepis

峰号 保留指数 化合物 峰面积 鉴定方法1 823 丁酸 0.15 MS，RI 2 854 （E）－2－己烯醛 0.26 MS，RI 3 856 （Z）－－2－甲基－3甲烯基－5－ 烯 0.38 MS，RI 4 867 n－Hexanol正己醇 0.24 MS，RI 5 906 2，5－二甲基－3－乙烯基－1，4－己二烯 1.46 MS，RI 6 922 黏蒿三烯 1.37 MS，RI 7 937 α－蒎烯 1.32 MS，RI 8 973 桧烯 2.06 MS，RI 9 978 β－蒎烯 2.15 MS，RI 10 992 β－月桂烯 1.32 MS，RI 11 996 3，3，6－三甲基－1，4－庚二烯－6－醇 0.68 MS，RI 12 1 005 α－水芹烯 0.35 MS，RI 13 1 030 柠檬烯 2.45 MS，RI 14 1 033 桉油醇 11.30 MS，RI，Co 15 1 064 3，3，6－三甲基－1，5庚二烯－4－酮 0.24 MS，RI 16 1 081 3，3，6－三甲基－2，5庚二烯－4－醇 0.67 MS，RI 17 1 085 3，3，6－三甲基－1，5庚二烯－4－醇 0.65 MS，RI 18 1 098 芳樟醇 1.87 MS，RI 19 1 102 侧柏酮 2.21 MS，RI 20 1 109 脱氢芳樟醇 0.33 MS，RI 21 1 125 菊油环酮 0.28 MS，RI 22 1 140 （Z）－桧萜醇 1.05 MS，RI 23 1 142 6，6－二甲基－2－亚甲基双环［3，1，1］庚－3－醇 1.27 MS，RI 24 1 146 樟脑 8.21 MS，RI，Co 26 1 149 （E）－侧柏醇 0.35 MS，RI 27 1 153 香茅醛 0.44 MS，RI 28 1 162 松香芹酮 0.29 MS，RI 29 1 165 龙脑 3.03 MS，RI 30 1 177 松油烯－4醇 7.32 MS，RI，Co 31 1 191 α－松油醇 1.24 MS，RI 32 1 230 香茅醇 1.26 MS，RI 33 1 242 香芹酮 1.35 MS，RI 34 1 248 （Z）－－3，7－二甲基－2，6－辛二烯－1－醇 1.82 MS，RI 35 1 258 （E）－3，7－二甲基－2，6－辛二烯－1－醇 1.87 MS，RI 36 1 293 侧柏醇乙酯 1.38 MS，RI 37 1 349 α－毕澄茄烯 0.38 MS，RI 38 1 354 乙酸－3，7－二甲基－6－辛烯酯 0.34 MS，RI 39 1 356 丁香酚 0.47 MS，RI 40 1 376 α－可巴烯 0.36 MS，RI 41 1 385 波旁烯 0.53 MS，RI 42 1 388 乙酸香叶酯 0.29 MS，RI 43 1 392 异戊酸苯甲酯 0.37 MS，RI 44 1 408 α－古芸烯 0.43 MS，RI 45 1 418 石竹烯 5.37 MS，RI，Co 46 1 433 γ－榄香烯 1.36 MS，RI

续表1

2.2 褐苞蒿精油抑菌生物活性测定

试验采用圆盘扩散法和微量稀释法测定褐苞蒿精油对供试细菌的抑制作用。褐苞蒿精油对几种常见的病菌的抑制效果见表2。由表2可知，在5株供试菌中，褐苞蒿精油对两株革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）的抑菌性表现最好，其次为革兰氏阴性菌（大肠埃希氏菌）。

表2 褐苞蒿精油的抑菌生物活性测定结果Table 2 Antimicrobial activity of the A.phaeolepis essential oil

从以往文献可知，多种蒿属植物，例如Artemisia asiatica［7］，Artemisia douglasiana［8］，Artemisia herba－alba［9］均 具有广谱的抗菌作用；目前认为蒿属植物的挥发油成分，例如多种小分子萜及萜氧化物，如樟脑、桉油醇、4－萜烯醇、石竹烯对细菌的细胞膜有破坏作用［10，11］。因此，可以认为褐苞蒿精油是多种成分协同作用的结果。

3 结论

本研究从采自山西五台山的褐苞蒿挥发油中分离鉴定出65个化学成分（占总挥发油的92.70%，其中主要含有结构多样的单萜、倍半萜类化合物），本试验结果与文献［7－9］报道的来源于其它种的蒿属植物挥发油在化合物组成和含量上存在一定差异，究其原因可能与植物的品种或来源地相关。抗菌试验表明褐苞蒿精油具有一定的广谱抗菌能力，尤其对革兰氏阳性菌具有很好的抑制作用。本试验开展褐苞蒿精油的化学成分及抗菌活性研究，试验结果可为今后褐苞蒿精油相关活性的开发利用提供有效借鉴和科学依据。

1 He Z Z，Yan J F，Song Z J，et al.Chemical constituents from the aerial parts of Artemisia minor［J］.Journal of Natural Products，2009，72（6）：1 198～1 201.

2 戴小军，刘延庆，梅全喜.蒿属药用植物药理活性研究进展［J］.中药材，2005，28（3）：243～247.

3 Tan R X，Wang W Z，Yang L，et al.A new eudesmenoic acid from Artemisia phaeolepis［J］.Journal of Natural Products，1995，58（2）：288～290.

4 国家药典委员会.中华人民共和国药典（I部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.

5 Zhu L，Tian Y J，Yin Y C，et al.Chemical composition and antimicrobial activities of the essential oils from flowers，leaves and stems of Wedelia urticifolia［J］.Italian Journal of Food Science，2012，24（1）：1～7.

6 Su J Y，Zhu L，Tian Y J.Chemical composition and antimicrobial activities of essential oil of Matricaria songarica［J］.International Journal of Agriculture and Biology，2012，14（1）：107～110.

7 Kalemba D，Kusewicz D，Swiader K.Antimicrobial properties of the essential oil of Artemisia asiatica Nakai［J］.Phytotherapy Research，2002，16（3）：288～291.

8 Setzer W N，Vogler B，Schmidt J M，et al.Antimicrobial activity of Artemisia douglasiana leaf essential oil［J］.Fitoterapia，2004，75（2）：192～200.

9 Mighri H，Hajlaoui H，Akrout A，et al.Antimicrobial and antioxidant activities of Artemisia herba－alba essential oil cultivated in Tunisian arid zone［J］.Comptes Rendus Chimie，2010，13（3）：380～386.

10 Lopes－Lutz D，Alviano D S，Alviano C S，et al.Screening of chemical composition，antimicrobial and antioxidant activities of Artemisia essential oils［J］.Phytochemistry，2008，69（8）：1 732～1 738.

11 Lv F，Liang H，Yuan Q P，et al.In vitro antimicrobial effects and mechanism of action of selected plant essential oil combinations against four food－related microorganisms［J］.Food Research International，2011，44（9）：3 057～3 064.