前列地尔脂微球注射液中游离药物浓度测定方法研究

马玉樊，卢婷利，崔 晗，周四元，陈 涛，

（1.西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072； 2.中国人民解放军第四军医大学，陕西 西安 710032）

前列地尔即前列腺素 E1（PGE1），是一种广泛存在于体内的生物活性物质，具有舒张血管平滑肌、改善血液循环、调血脂、降低血黏度及一定的直接溶栓作用。将其制备成制剂，在治疗糖尿病神经病变及脑血管病领域中得到了广泛应用。PGE1在水溶液中易水解，分散于水溶液中的PGE1在体内能被快速灭活，故无法产生预期的治疗效果。PGE1可很好地分散在油相中，据此特性将其开发成为前列地尔脂微球（Lipo-PGE1）制剂，成功克服了PGE1水针剂稳定性差以及体内代谢快的缺点[1-3]。Lipo-PGE1可有效地将PGE1输送到血管病变部位，使局部药物浓度显著升高，产生良好的治疗效果[4]。目前Lipo-PGE1制剂的质量标准中仅要求对药物含量进行测定，但对于脂微球包裹药物的量和游离药物并未作出相关的技术要求。大量研究显示，Lipo-PGE1中游离的PGE1含量是决定PGE1药效强度及不良反应的最重要因素。本试验中建立了检测Lipo-PGE1中游离PGE1含量的方法，分别采用不同规格的超滤膜、以不同离心速率对前列地尔脂微球样品进行处理，分别检测了目前市售不同厂家的Lipo-PGE1制剂，并在此基础上建立了一种可快速准确分析Lipo-PGE1制剂中游离PGE1含量的新方法。

1 仪器与试药

离心机（Beckman coulter， Microfuge 22R centrifuge）； Waters Quattro Premier型号液质联用系统，马尔文Zeta激光粒度和ZETA电位仪；Millipore超滤离心管3K，10K，30K（上海肯强仪器有限公司）。前列地尔注射液（样品1，商品名为凯时，北京泰德制药有限公司，批号为2010N，规格为2 mL∶10μg；样品2，商品名为喜通，西安力邦制药有限公司，批号为1012281，规格为 2 mL∶10μg）。前列地尔标准品（上海瑞齐生物科技有限公司，批号为140659，规格为每支8mg）；甲醇、乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 Lipo-PGE1样品表征

取Lipo-PGE1样品，用超纯水稀释1 000倍，用激光粒度仪检测平均粒径。取Lipo-PGE1样品100μL，置10 mL容量瓶中，用甲醇破乳定容，制成50 ng/mL甲醇溶液，液质联用检测样品中PGE1，响应值带入标准曲线计算 PGE1含量。结果见表1。可见，样品1、样品2脂微球的粒径和含量接近。

表1 不同Lipo-PGE1样品粒径、含量检测结果

2.2 样品处理方法

超滤膜分子量的选择:分别移取样品1 500μL，置3，10，30 K分子量超滤离心管中，配平，以5 000 r/min的速率 4℃离心30 min，观察下清液外观，量取下清液体积。结果见表2。可见，使用3 K分子量超滤管离心，分子量过小，离心下清液体积过少，不易检测含量；30 K分子量超滤管分子量过大，有小分子量的乳滴离心到下清液中，影响含量的测定。故选定10 K分子量的超滤管。

离心速度的选择:分别移取样品1 500μL，置10 K分子量超滤离心管中，配平后置离心机中以3 000，5 000，8 000 r/min的速率4℃各离心30 min，观察下清液外观，量取下清液，液质联用检测，每个转速下处理3个样品，测定吸收峰面积，最后取平均值。结果见表 3。可见，3000 r/min 转速过低，无下清液离出；8 000 r/min转速下离心下清液中游离PGE1含量测定的重现性不好，可能是由于转速过高有少量的小分子量的乳滴离出；5 000 r/min转速下离心下清液中游离PGE1含量测定重现性好，较稳定。因此，转速取 5 000 r/min。

表2 使用不同分子量的超滤管离心下清液情况

表3 不同转速下离心Lipo-PGE1下清液情况

2.3 样品中游离药物含量测定

2.3.1 检测条件

色谱条件:色谱柱为 Xterra MS C18柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相为乙腈 -水(85 ∶15)；流速为 0.3 mL/min；柱温室温；进样量 2μL。

质谱条件:电喷雾电离源（ESI），以选择反应离子监测（SRM）方式进行检测；电喷雾电压为3.5 kV，加热毛细管温度为350℃，鞘气（N2）流速为 10.0 L/min，辅助气（N2）流速为 1.7 L/min，碰撞气（Ar）压力为0.1 Pa；碰撞能量为12 eV；用于定量分析的反应离子为 m/z353.0 → 317.0，扫描时间为 0.1 s。

2.3.2 样品检测方法

样品1、样品2各取500μL，置一定分子量的超滤离心管内，配平，以5 000 r/min的速率4℃离心30min，取下清液液质联用检测游离PGE1质量浓度，每个样品处理3个平行样品，检测后取平均值。

2.3.3 方法学考察

专属性考察:PGE1在拟订的色谱条件下出峰良好，出峰时间为 1.38 min，见图 1。离心下清液中其他成分不干扰 PGE1的测定，故方法具有较强的专属性。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精确称取25 mg PGE1标准品，置25 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，制备1 g/L的PGE1溶液。然后用甲醇稀释制备 1 μg/mL 的 PGE1贮备液。移液枪分别量取 10，20，30，40，50，60，80μL 的 1μg/mL 的 PGE1贮备液，再量取一定量的甲醇定容至 1mL，则分别制得 10，20，30，40，50，60，80 ng/mL 的 PGE1标准溶液。取各标准溶液进样检测，以样品响应值为纵坐标，PGE1标准溶液浓度为横坐标做图，得线性方程为 Y＝5.758 6X+7.127 5，r＝0.997 2(n＝7)。结果表明，前列地尔质量浓度在 5 ～60 ng/mL范围内与峰面积线性关系良好。以 S/N＞3计，最低检出限为5 ng/mL。取50 ng/mL的前列地尔标准品溶液，连续进样分析6次，测定响应值，计算得响应值的 RSD为0.73%。

稳定性试验:取同一份离心下清液样品，分别于 0，1，2，3，4，5 h时按拟订色谱条件进样，测定峰面积。结果的 RSD为0.43%(n＝6)，说明供试品在5 h内稳定。

重复性试验:取同一批样品6份，按照样品处理过程离心取下清液，测定 PGE1含量。结果的 RSD为0.96%，表明方法重现性良好。

加样回收试验:精密吸取空白脂肪乳离心下清液适量，精确加入PGE1标准品溶液适量，使其最终质量浓度为含量测定中样品浓度的80%，100%，120%，每个浓度制备3个样品，依法测定。结果其平均回收率分别为 96.3%，97.1%，95.9%，RSD 分别为 1.01% ，0.70% ，0.93% 。

2.3.4 游离 PGE1浓度检测结果

取Lipo-PGE1样品100μL，置10 mL容量瓶中，用甲醇破乳定容，制成50 ng/mL甲醇溶液，液质联用检测样品中 PGE1，把检测到的样品响应值带入标准曲线中，计算得游离前列地尔的质量浓度，结果见表4。可见，样品1中游离PGE1含量显著大于样品2。

表4 不同PGE1样品中游离药物检测结果

3 讨论

大量研究显示，Lipo-PGE1中游离的PGE1含量是决定PGE1药效强度的最重要因素。Yamauchi等[6]发现，Lipo-PGE1的治疗效果会随着其游离PGE1含量的改变而相应改变。Yukiko等[7]人分别用生理盐水和脂肪乳稀释的Lipo-PGE1进行大鼠试验，结果发现用生理盐水稀释的Lipo-PGE1药效降低，而用脂肪乳稀释的Lipo-PGE1药效不变。关于这一现象的解释有2种:一者可能是由于PGE1在生理盐水中不稳定，但已有研究表明PGE1在20℃生理盐水中放置9 d后，仅有极少量的PGE1分解[8]，90%的PGE1仍稳定存在。另外一种解释是当用生理盐水或其他水溶液稀释Lipo-PGE1时PGE1从脂肪乳中释放出来的速率增加[9]，结合的PGE1量减少，因此输送到病变部位的PGE1量减少，药效降低。研究发现，Lipo-PGE1用生理盐水稀释10倍后包合的PGE1量迅速减少了53.2%，而用脂肪乳稀释的 Lipo-PGE1中包合的PGE1量仅损失了13%[10]。

2010年版《中国药典(二部)》收载的PGE1检测方法为经氢氧化钠异构化后采用高效液相色谱在214 nm波长处检测[11-12]。该方法碱异构化耗时较长，样品处理条件要求高，经过衍生处理后样品分析灵敏度受限，因此无法实现对Lipo-PGE1中游离PGE1含量的检测，且目前国内外文献并无相关检测方法的报道。考虑到Lipo-PGE1中游离PGE1含量对Lipo-PGE1制剂药效影响，开发出了检测 Lipo-PGE1中游离PGE1的方法。该方法采用膜分离技术将脂微球注射液进行相分离，通过验证确认适合相分离的膜材孔径，并且考察了分离转速对分离效果的影响。经方法学验证确认，该方法科学简便、检测高效、灵敏度高。

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