芦荟大黄素对人永生化角质形成细胞增殖和凋亡作用研究

曾德贵 ，莫衍石 ，刘荣丰 ，杨春燕 ，林世平 ，陈小谊 ，兰柳波

（1.广东省深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518020； 2.广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东 湛江 524023）

芦荟（aloe）属多年生常绿肉质草本植物，具有很高的药用价值，性苦、寒，可清肝热、通便[1]。现代医学研究发现，芦荟的药用有效成分十分复杂，主要有大黄素、大黄酚、蒽醌等物质，其中起抑菌作用的成分主要是芦荟大黄素生物活性物质[2]。银屑病是由于角质形成细胞过度增殖引起的一种具有遗传倾向的炎症性增殖性皮肤病，临床缺乏有效的治疗药物。目前尚未见关于芦荟用于临床治疗银屑病的报道，但有研究报道了芦荟对银屑病患者外周血单核细胞和角质形成细胞增殖的影晌[3-5]。人永生化角质形成细胞HaCaT是一种永生化的角质形成细胞株，具有永生性和与角质形成细胞相似的增殖、分化特性，遗传特性稳定，不具有成瘤性，常用来替代人表皮角质形成细胞进行研究[6]，是研究药物治疗银屑病疗效常用的体外细胞模型。本研究中拟从芦荟中提取芦荟大黄素，检测其对HaCaT细胞增殖能力、细胞形态、细胞周期及凋亡的影响，从而为芦荟治疗银屑病提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

旋转蒸发器（EYELA，上海爱朗仪器有限公司）；全自动酶标仪、低速离心机（美国Sigma公司）；倒置相差显微镜（Olympus，日本）；流式细胞仪（美国BD公司 FAC scalibur流式细胞仪）；CO2细胞培养箱（日本三洋公司）。芦荟采自广东徐闻县境内；对照品芦荟大黄素购自中国药品生物制品检定所（787-9001）。人角质形成细胞（HaCaT细胞）购自中国典藏培养物保藏中心。DMEM培养基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶(Gibco公司)。PI染色试剂盒（联科生物）。

1.2 方法

1.2.1 芦荟大黄素的提取与制备

取中药材芦荟约100 g，洗净、粉碎、酸化后风干，用本课题组建立的工艺路线提取得到芦荟大黄素提取物。经鉴定，其成分的分子结构与对照品芦荟大黄素一致。用DMSO溶解配制成质量浓度为 10 g/L的芦荟大黄素提取物药液，用 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，试验前用细胞培养液稀释成所需质量浓度，DMSO终浓度小于或等于 0.1%（V/V）。试验表明，该浓度对细胞生长无影响。

1.2.2 细胞培养

将 HaCaT细胞以5×105个/mL接种于含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基，置37℃及5%CO2培养箱。在细胞数达1×109/mL前用完全培养基重新悬浮，并以1∶3的比例传代，取对数生长期细胞进行试验。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期 HaCaT细胞，以2.0×104mL接种于96孔培养板中，每孔100μL；接种24h后分别加入不同质量浓度药物，使芦荟大黄素终质量浓度分别为20，40，80μg/mL，每个质量浓度设3～5个平行孔，并设空白对照组、溶剂对照组；给药48 h后，每孔加入 20 μLMTT（5 g/L），继续培养 4 h，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗板1次，再加入 DMSO，每孔 100μL，室温震荡摇匀10 min，用酶标仪在492 nm波长处测定吸光度（OD）值，并计算增殖抑制率。抑制率（%）＝（1-给药组 OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.4 倒置显微镜观察细胞形态学变化

取对数生长期细胞，接种于25 cm2的培养瓶，当细胞长满培养瓶底约60%时置于光学显微镜下观察细胞形态后加药。设空白对照组，培养24 h后，于倒置显微镜下观察细胞形态变化并作记录。

1.2.5 流式细胞术检测芦荟大黄素对HaCaT细胞周期的影响

取对数期生长状态良好的HaCaT细胞，制成单个细胞悬液，以每孔约104个细胞接种于6孔培养板上，待细胞生长融合到70%～80%时，加入不同质量浓度的芦荟大黄素，每个药物质量浓度设3个平行孔。作用48 h后用胰酶消化，收集细胞，并用无血清培养基洗涤细胞两次后用100μL无血清培养基重悬细胞，加入预冷的70%乙醇，4℃固定。上机前离心，去上清，并用PBS 5 000 r/min洗涤细胞2次，每次5 min。分别在每个样品中加入100μL RNaseA，于37℃温水中水浴30 min后加入PI进行染色，4℃避光30min后，上流式细胞仪检测细胞周期。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 芦荟大黄素对HaCaT细胞增殖的影响

MTT检测结果显示，芦荟大黄素可显著抑制体外培养的Ha-Cat细胞的生长，且随着药物质量浓度增加抑制作用增强，即呈一定范围的剂量依赖性，见表1。可见，不同质量浓度药物组吸光度明显减少，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 芦荟大黄素作用于HaCaT细胞48 h的抑制效应（±s，n＝3）

表1 芦荟大黄素作用于HaCaT细胞48 h的抑制效应（±s，n＝3）

组别对照组0.1%D M S O 组低剂量组中剂量组高剂量组质量浓度（ g/mL）--2 0 4 0 8 0 O D 492 2.3 0 ± 0.1 2 2.3 4 ± 0.0 8 1.9 1 ± 0.1 7 0.9 0 ± 0.1 8 0.7 6 ± 0.1 5抑制率（%）0.0 0-2.0 0 1 6.9 5 6 0.0 8 6 6.9 5

2.2 细胞形态学观察

在倒置显微镜下观察，空白对照组细胞数量多，密度大，细胞呈梭形或不规则形，折光性强；经一定质量浓度芦荟大黄素处理后细胞数量明显减少，细胞体积变小、变形，出现皱缩、变圆、脱落，细胞折光性减低。

2.3 细胞凋亡的流式细胞仪分析

不同质量浓度的芦荟大黄素作用于HaCaT细胞48 h后，S期细胞与对照组相比明显增加，G0/G1期比例降低，可见药物将细胞阻滞于S期。见表2。

表2 芦荟大黄素作用于HaCaT细胞48 h后对细胞周期的影响（±s，n＝3）

表2 芦荟大黄素作用于HaCaT细胞48 h后对细胞周期的影响（±s，n＝3）

注:与对照组相比，P ＜0.05。

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组质量浓度（ g/mL）-2 0 4 0 8 0 G 0/G 1 2 5.8 1 3.7 1 5.4 1 1.6 S 5 0.3 6 4.0 5 9.1 7 2.5 G 2/M 2 3.8 2 2.4 2 5.5 1 6.0

3 讨论

银屑病是常见慢性炎症性皮肤病，顽固且易复发。研究表明，银屑病大多表现为角质形成细胞过度增殖及异常分化。细胞凋亡与增殖是生物体内一对并存的矛盾，正常情况下二者维持动态平衡，因而细胞凋亡与增殖变化紧密相关。多数学者认为，银屑病患者皮损中角质形成细胞的凋亡受阻，在银屑病中表达异常，并且与银屑病角质形成细胞过度增生、炎症细胞浸润有关。在银屑病发病相关的角质形成细胞凋亡研究中，一般均使用HaCat细胞作为正常角质形成细胞模型[7]。本研究中，采用体外培养的HaCaT细胞，研究芦荟大黄素对HaCaT细胞增殖能力的影响，试验分别采用MTT法检测细胞生长状况、倒置显微镜进行形态学观察，以及流式细胞仪检测细胞周期。细胞的增殖力、形态、细胞周期3个方面变化的结果表明，芦荟大黄素对HaCaT细胞的作用具有一定范围内的剂量依赖关系，但这种依赖并非简单线性关系，而是呈现出随机非线性的特点。在低质量浓度药物时几乎不影响HaCaT细胞生长，但用高质量浓度药物处理细胞后，其生长受到明显抑制，甚至出现大部分凋亡、裂解成碎片的现象。

采用流式细胞术对细胞周期的研究结果表明，不同质量浓度的芦荟大黄素均能降低细胞G1期时相的比例，使S期时相的比例上升，而将细胞阻滞于S期(即DNA合成期)，即其可能通过阻止细胞的DNA合成来抑制细胞增殖，从而抑制细胞有丝分裂并诱导其凋亡。

综上所述，芦荟大黄素质量浓度在20～80μg/mL范围内能明显抑制HaCaT细胞的增殖，且抑制能力随药物质量浓度升高而增强；并可通过将细胞阻滞于S期诱导其凋亡。此作用机理为应用芦荟大黄素治疗提供了药理学依据，但由于体内外试验的差异，其临床治疗银屑病的机制尚需进一步的研究。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中国人民共和国药典（一部）[M].北京:中国医药科技出版社，2010:151.

[2]李志富，邵 伟，丁 静，等.芦荟植物提取液抑菌效果及毒性试验研究[J].中国消毒学杂志，2008，25（4）:384-385.

[3]朱可建，周伟芳，劳力民，等.银屑病患者外周血单核细胞向树突状细胞分化能力的研究[J].中华皮肤科杂志，2002，35（2）:88-90.

[4]徐丽敏，李 虹，毛舒和，等.芦荟对银屑病患者外周血单一核细胞产生干扰素- 的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2003，2（3）:162-163.

[5]徐丽敏，王彦红，李 虹，等.芦荟对银屑病患者外周血单核细胞和角质形成细胞增殖和凋亡的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2005，4（4）:123-125.

[6]余靖宏，赵瑞芝，卢传坚.银屑灵优化方对银屑病豚鼠及炎性刺激角质形成细胞增殖的影响[J].中华中医药杂志，2013，28（5）:1 531-1 534.

[7]陈小娥，骆 丹.角质形成细胞的凋亡失调及相关皮肤病[J].国际皮肤性病学杂志，2007，33（2）:101-103.