海南黄灯笼辣椒小叶病病原物的分子鉴定

郑文虎等

摘 要 采用分子生物学技术对田间疑似植原体侵染引起的小叶症状的黄灯笼辣椒样品进行检测，以明确其病原分类地位。利用植原体通用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，对上述黄灯笼辣椒叶片DNA进行巢式PCR扩增。结果表明：获得约1.2 kb的特异片段，经序列测定、Blast同源性检索及进化树和iPhyClassifier分析，获得该特异片段长为1 248 bp，与植原体16S rⅡ组中的花生丛枝植原体（L33765）同源性最高，达99%，聚类在同一个进化枝上，相似性系数为1.00，归属于16S rII-A亚组。暂将其命名为黄灯笼辣椒小叶植原体（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL）。

关键词 黄灯笼辣椒小叶病；植原体；16S rDNA；分子鉴定

中图分类号 S432.1 文献标识码 A

Molecular Identification of the Pathogen of Capsicum

chinense Jacquin Little-leaf Disease in Hainan

ZHENG Wenhu1，2， CHE Haiyan1*， YANG Yi1， CAO Xueren1， LUO Daquan1**

1 Environment and Plant ProtectionInstitute，CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Tropical Grops，Ministry of Agriculture，P.R.China/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control

of Tropical Agricultural Pests，Haikou，Hainan 571101， China

2 Sanya Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Sanya， Hainan 572000，China

Abstract In the paper， to ascertain taxonomic status of pathogen，Capsicum chinense Jacquin samples with little leaf symptom which were suggestive of phytoplasma infection，were detected by molecular biology. Primers R16mF2/R16mR1 and R16F2n/R16R2 were used to amplify the DNA samples from symptoms above by nested PCR. The PCR products were sequenced and Blast searching in GenBank. The phylogenetic tree and iPhyClassifier analysis of the 16S rDNA sequences showed that the sequence shared the identity of 99% with that from Peanut witches'-broom（L33765）， and clustered in the same clade， with similarity coefficient of 1.00. The phytoplasma belonged to 16S rII-A subgroup，was tentatively named as Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL.

Key words Capsicum chinense Jacquin little leaf disease；Phytoplasma；16S rDNA；Molecular identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.024

植原体（phytoplasma）是一类能引起植物病害的重要病原物，已在1 000余种罹病植物中检测到该病原物，给世界各地的经济作物造成很大损失[1]。在中国，能够造成严重危害的植原体病害主要有枣疯病、泡桐丛枝病、槟榔黄化病等[2-4]。由于植原体不能人工培养，影响了对其进行分类等方面的深入研究，但是随着分子生物学和生物信息学的发展，其分类鉴定依据逐渐丰富起来。Lee等[5]在2000年综合分析了植原体16S rRNA和核糖体蛋白基因的序列，形成了一个包括19个组和46个亚组植原体种类的分类体系，为后来植原体的分类打下了基础，在植原体的分类上具有重要意义。

黄灯笼辣椒（Capsicum chinense Jacquin），又名黄帝椒、黄辣椒，是海南特有的辣椒品种，适宜在海南的东南、西南沿海地区栽培，含有丰富的辣椒素、维生素C、胡萝卜素及多种矿物质[6]。目前，国内外相关研究者在辣椒上发现多种植原体病害，田间表现为叶片黄化、矮缩、小叶、丛枝、变叶、结果量减少及果实变小等症状，这些植原体属于16S rⅠ组、16S rⅢ组，16S rⅥ组、16S r Ⅻ组等[7-11]。黄灯笼辣椒在田间常见的病害为病毒病[12-13]，其它病害的研究报道很少。笔者在田间调查过程中首次在海南省儋州市宝岛新村发现了疑似被植原体侵染而表现小叶症状的黄灯笼辣椒样品，本研究拟采用分子生物学和生物信息学方法对上述样品进行检测和分析，以明确其病原及分类地位。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 3株表现典型小叶症状的黄灯笼辣椒样品采自海南省儋州市宝岛新村，分别编号为PH1、PH2和PH3。健康黄灯笼辣椒样品与上述3株样品采自同一田块。

1.1.2 菌株和质粒 E. coli Competent Cell DH5α、克隆载体pMD18-T购自大连宝生物（TaKaRa）公司。

1.2 方法

1.2.1 植物总DNA提取 参照Lee等[14]的方法进行样品总DNA的提取置于-20 ℃贮存。

1.2.2 植原体16S rDNA基因的巢式PCR扩增和克隆 根据Gundersen等[15]和Lee等[16]报道的引物对扩增植原体16S rDNA基因片段序列，以R16mF2/R16mR1作为第一引物对，R16F2n/R16R2作为第二引物对，进行巢式PCR扩增。引物对序列如下：

R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′；

R16mR1：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′；

R16F2n：5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′；

R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCC

CG-3′。

引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

巢式PCR第一次和第二次反应体系为25 μL：ddH2O 17.3 μL， 10×Taq buffer（Mg2+）2.5 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL， DNA模板 1.0 μL， Taq DNA polymerase（5 U/μL） 0.2 μL。

巢式PCR第一次和第二次反应条件为： 94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性1 min， 45 ℃退火1 min， 72 ℃延伸2 min， 进行5个循环； 94 ℃变性30 s，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，进行25个循环；最后72 ℃延伸10 min。以健康植株总DNA为对照。

PCR 扩增产物以TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 纯化回收，将目标产物与pMD18-T载体连接，转化到感受态细胞DH5α中，利用菌落PCR反应筛选阳性克隆。

1.2.3 序列测定与分析 序列测定委托英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。利用DNAMAN（6.0.3.99版本）分析软件进行序列装配；利用基因数据库GenBank中的BLAST程序对测序结果进行同源性检索；进化树分析采用MEGA4.0.2，采用最大简约法 Maximum Parsimony 分析，使用近邻交换算法 Close-Neighbor-Interchange 完成，以 1 000为重复值进行 Bootstrap效验；使用植原体分类鉴定的在线软件iPhyClassifier（http：//plantpathology.ba.ars.usda.gov）对16S rDNA序列进行RFLP电子酶切。

2 结果与分析

2.1 田间症状表现

罹病黄灯笼辣椒植株表现矮化，高度仅为健康植株的1/2左右，叶片短小丛生，叶面积不足健叶的1/5，叶脉扭曲呈疙瘩节状，叶色略微发黄，叶肉变薄（图1）。

2.2 PCR检测结果

利用植原体通用引物对从表现小叶症状的黄灯笼辣椒叶片总DNA中扩增到大小约1.2 kb的特异片段，片段大小与Lee等[16]报道的相符，而健康黄灯笼辣椒叶片总DNA和空白对照均未出现特异扩增条带（图2）。

2.3 植原体16SrDNA基因片段的序列分析

将PH1、PH2和PH3样品中扩增到的特异片段进行纯化、克隆及测序。结果表明，上述3个样品的16S rDNA扩增片段的测序结果相同，均含有1 248个核苷酸，G+C的含量为47.36%，GenBank 登录号为JQ957928。同源性检索发现，与该序列同源性较高的均为16S rⅡ组中的植原体16S rDNA序列，其中与花生丛枝植原体（Peanut witches-broom phytoplasma，PnWB，GenBank 登录号：L33765）的同源性最高，达99%，将该植原体株系暂命名为黄灯笼辣椒小叶植原体（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL）。

2.4 构建系统进化树

黄灯笼辣椒小叶植原体与其它相关植原体株系构建的系统进化树（图3）表明，黄灯笼辣椒小叶植原体（CcJLL）与植原体16S rⅡ组成员聚类在同一个进化枝上，其中与16S rⅡ组成员PnWB（L33765）聚类在同一个小进化枝上。

2.5 计算机模拟16S rDNA-RFLP电子酶切图谱及相似系数分析

黄灯笼辣椒小叶植原体（CcJLL）16S rDNA序列的RFLP电子酶切图谱（图4）分析表明，黄灯笼辣椒小叶植原体（CcJLL）与16S rⅡ-A亚组中的花生丛枝植原体（Peanut witches-broom phytoplasma，GenBank 登录号：L33765）相似性系数为1.00，而且17种酶的电子酶切图谱完全一致，可见黄灯笼辣椒小叶植原体（CcJLL）属于16S rⅡ-A亚组。

3 讨论与结论

本研究利用植原体通用引物对从表现小叶症状的辣椒叶片总DNA中扩增到植原体16S rDNA片段，该片段长1 248 bp，说明采集的样品中存在植原体，进一步通过Blast同源性检索及进化树和iPhyClassifier分析确定该植原体为16SrⅡ-A亚组成员，暂将其命名为黄灯笼辣椒小叶植原体（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma， CcJLL），这是首次在黄灯笼辣椒上发现植原体的存在。Li等[11]在陕西杨凌发现辣椒上存在辣椒丛枝植原体（Pepper witchesbroom phytoplasma），属于16S rⅠ-B亚组成员。该植原体与本研究中发现的植原体分属于不同的组。由于植原体至今尚不能人工培养，影响了植原体的分类研究，目前仅利用16S rDNA等少数几个基因对植原体进行分类，存在一定的局限性。相信随着更多的植原体全基因组序列测定的完成，将会建立更加完善的分类方法和分类体系。

黄灯笼辣椒可开发成美味的调料，也可作为医药工业的原料，是海南最具发展潜力的特色农作物之一。本研究的黄灯笼辣椒小叶病样品采自海南省儋州市宝岛新村，发生病害面积很小，关于该病害对黄灯笼辣椒产业的影响还有待进一步研究。鉴于黄灯笼辣椒小叶植原体与花生丛枝植原体16S rDNA基因序列间具有高度一致性，能同时在此类植物上取食的叶蝉、飞虱类昆虫很可能是它们的共同介体，这还但有待于进一步的研究。在黄灯笼辣椒小叶病发生地也未发现其他疑似植原体感染的植物。Vladimir等[10]在墨西哥的Baja California Sur州发现表现黄化症状的辣椒植株，通过检测发现，该样品中存在16S rⅫ组植原体和2种双生病毒的混合侵染。本研究中表现小叶症状的辣椒样品是否由CcJLL单独侵染引起，还是存在其他植原体株系以及病毒的复合侵染，还有待于进一步通过生物学和分子生物学方法进行验证。

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责任编辑：林海妹