2种不同启动子驱动下1—SST基因转化甘蔗的抗旱性比较

武媛丽等

摘 要 将从菊芋中克隆到的蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶基因（即1-SST基因），与根部特异性表达启动子pPST2a组合，通过农杆菌介导法获得转pPST2a：1-SST基因甘蔗植株，通过分子检测共得到15个阳性转基因株系。将前期工作得到的转rbcs：1-SST基因甘蔗5个株系与转pPST2a：1-SST基因甘蔗进行抗旱性比较。结果发现，转pPST2a：1-SST基因甘蔗的抗旱性高于转rbcs：1-SST基因甘蔗。与启动子rbcs相比，启动子pPST2a能够更大程度上增强转1-SST基因甘蔗植株的抗旱性。

关键词 果聚糖；1-SST；转基因甘蔗；抗旱性比较

中国分类号 S59；Q812 文献标识码 A

Drought Resistance of the Transformed Sugarcanes with

1-SST Gene Driven by Two Different Promoters

WU Yuanli，ZHANG Shuzhen，LI Xiaojun，CAI Wenwei，YANG Benpeng*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/

Sugarcane ResearchCenter， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology

and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Fructan is a nonreducing polysaccharides of glucose that functions as a protectant in the stabilization of biological structures and enhances the stress tolerance under abiotic stresses in organisms. The sucrose：sucrse 1-fructosyltransferase（1-SST） gene from Jerusalem artichoke combined with root specific promoter pPST2a was transferred into sugarcane（Saccharumofficinarum L.）using Agrobatorium-mediated method. Results indicated that 15 pPST2a：1-SST transgenic lines were successfully obtained according to molecular detection. Compared the drought resistance of the transgenic sugarcane between the one with pPST2a：1-SST lines obtained in the study and the other one with rbcs：1-SST obtained in previous research. The resuults showed that drought resistance of the transgenic sugarcane with pPST2a：1-SST lines was better than the one with rbcs：1-SST. And it revealed that promoter pPST2a could make drought resistance of transgenic sugarcane even stronger than the promoter rbcs.

Key words Fructan；1-SST；Transgenic sugarcane；Comparison of drought resistance

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.001

甘蔗是世界上最为重要的糖料作物，也是理想的可再生能源作物。甘蔗食糖占中国食糖总量的90%以上[1]。干旱是最为常见的非生物胁迫之一，植物对于干旱的敏感性表现在因水分缺失而导致的渗透胁迫。目前，有80%以上的糖料甘蔗种植在缺乏灌溉条件的旱坡地。干旱严重影响糖料甘蔗的产量，已成为影响甘蔗生产范围最广、频率最高、损失最为严重的自然灾害之一。

植物对于干旱的敏感性之一，即表现在因水分缺失而导致渗透胁迫。植物在长期的进化过程中产生多种机制来适应这种逆境胁迫，如积累季胺类（甜菜碱）、氨基酸类（脯氨酸）、糖类（海藻糖、果聚糖、山梨糖醇）等[2-3]渗透调节物质。国内外很多研究证明，将微生物中编码高聚合度（degree of polymers， DP）果糖的果糖基转移酶基因（SacB基因）转入烟草（Nicotiana tobacum）、番茄（Lycopersicon esculentum）、甜菜（Beta vulgaris）、小麦（Triticum aestivum）后， 植株的耐旱性和耐盐性[4-8]均得到明显的提高。而由1-SST基因编码的蔗糖： 蔗糖-1-果糖基转移酶合成的低聚合度（DP=3）果聚糖对植物抗旱性改良的相关报道较少。李慧娟等[9]将1-SST转入模式植物烟草中，使烟草的抗旱性得到了明显的提高。叶兴国等[10]将1-SST基因转入小麦中，发现在水分胁迫处理前15 d内果聚糖积累量较低，水分胁迫21～28 d果聚糖开始积累，随着复水后干旱胁迫解除，果聚糖含量下降，低聚果糖的有效积累可提高小麦的抗旱能力。

目前，已获得的5个转rbcs：1-SST基因甘蔗株系被证实具有合成低聚果糖的能力并且该植株的抗旱性得到明显的提高。植物根部在抗旱及耐盐性上有重要的作用。因此，用根部特异性表达启动子pPST2a[11]替换原来的组成型表达的rbcs启动子。本研究分析转pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及盐胁迫影响，并将前期工作得到的转rbcs：1-SST基因甘蔗5个株系与pPST2a：1-SST基因甘蔗进行抗旱性比较，以期了解2种不同启动子作用下，转1-SST基因甘蔗的抗旱性差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 转rbcs：1-SST基因甘蔗株系T0代由本实验室试验田保存；抗性植株T0代幼苗由本实验室人工气候箱中保存。

1.1.2 供试试剂 PCR试剂购自宝生物公司，PCR引物合成及基因测序均由上海生工生物工程公司完成。其它常用的化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3 试验仪器 琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一仪器厂），德国Biometra T1 PCR仪，凝胶成像系统（BIO-RAD），Eppendorf PCR仪。电导率仪，超净工作台，人工气候箱等仪器设备均由热带生物技术研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 转pPST2a：1-SST基因甘蔗植株的获得 取抗性植株叶片，用SDS法小量提取其总DNA进行1-SST基因的PCR检测。检测引物： F1：5′-ACACAAACGGGCTGGACAT-3′，F2：5′-CATTTCC

CTACGCTTACATCCT-3′。扩增产物为1-SST基因中约750 bp片段。程序如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5个循环；94 ℃10 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，20 ℃保存。其中以含目的基因的重组质粒DNA作正对照，以未转化甘蔗的DNA为负对照，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析并照相。

1.2.2 转pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及盐胁迫试验 转pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗模拟干旱及干旱胁迫：将转pPST2a：1-SST基因植株随机选出8株和2株未经遗传转化的对照植株分为2组，每一组包括4个转基因植株和1个对照植株。一组培养在同一瓶含15% PEG6000的MS培养基中，模拟干旱胁迫。另一组培养在同一瓶吸足水分的保水剂中，此后不再供水，逐渐形成干旱环境，分别培养1个月后观察实验结果。

转pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗盐胁迫：将转pPST2a：1-SST基因的植株随机选出4株和1株未经转化的对照植株同时培养在200 mmol/L NaCl的MS培养基中，进行耐盐性测试，培养1个月后观察实验结果。

1.2.3 转pPST2a：1-SST基因甘蔗与转rbcs：1-SST基因甘蔗抗旱性的比较 分别将2种不同启动子的转基因甘蔗和未经遗传转化的甘蔗茎秆分别砍成大小相似的带芽茎段，种植到花盆中，6～7片叶龄后进行干旱胁迫，观察植株的萎蔫情况。取上述转rbcs：1-SST基因的甘蔗株系和转pPST2a：1-SST基因甘蔗株系以及未转化植株作为实验材料，检测这些植株的抗旱相关的生理生化指标。取相同部位的叶片进行测定，生理生化指标包括SOD（超氧化物歧化酶）活性、离体叶片保水率、叶片质膜透性（即相对电导率）[12]等。

1.2.4 数据分析 应用Microsoft Office Excel 2003、SPSS13.0等软件进行数据处理与分析（邓肯法p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 转pPST2a：1-SST基因甘蔗植株的获得

利用检测引物F1、F2进行转pPST2a：1-SST基因植株的PCR检测，共获得15个阳性植株。扩增产物经上海生工测序分析，表明扩增所得条带与目的基因片段完全一致。说明目的基因已经成功整合到甘蔗基因组中，PCR结果如图1。

2.2 转pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的干旱及盐胁迫影响

2.2.1 转pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的模拟干旱及干旱胁迫 植物对干旱最主要和最早期的反应是缺水，导致叶片萎蔫至干枯，生长受到极大的抑制甚至死亡。

由图2可知，在模拟干旱实验中转基因植株在15% PEG6000的培养基中叶片保持绿色，萎蔫程度较低，生长状况良好且有不同程度的分蘖，而非转化植株则已枯萎死亡。在干旱实验中，转基因植株地上部生长受到的抑制程度较低，叶片伸长较长，根系生长发达，而非转化植株的地上部生长相对矮小，根部伸长受到很大的抑制。在模拟干旱及干旱胁迫的条件下，转基因植株均表现出较强的生存及抗旱能力，转基因植株的地上部及地下部的生长情况好于未经转化的植株，尤其是根的发生和伸长都明显优于对照，说明启动子pPST2a在根中的特异性启动表达能力更有利于植株度过干旱逆境。

2.2.2 转pPST2a：1-SST基因的甘蔗幼苗的盐胁迫 盐胁迫直接造成植株生理干旱，植物对盐胁迫最主要反应是干旱和光合器官受损，导致叶片萎蔫至干枯，甚至死亡。

由图3可知，经过1个月的盐胁迫，转基因植株出现不同程度的黄化，根系生长也受到不同程度的抑制，但是总体表现出较好的耐盐性，而对照植株在盐胁迫中根系生长几乎趋于停滞，整个植株已经死亡。说明转pPST2a：1-SST基因甘蔗较对照植株有较强的抗盐性。

2.3 转pPST2a：1-SST基因甘蔗与转rbcs：1-SST基因甘蔗抗旱性的初步比较

2.3.1 干旱胁迫 通过抗旱性比较可以看出，在干旱胁迫下，各株系均出现不同程度的萎蔫，但是相比较之下，未经转化的植株由于缺水几乎完全枯黄，趋于死亡，转rbcs：1-SST基因甘蔗的株系的叶片也出现部分萎蔫和叶黄现象，而转pPST2a：1-SST基因的甘蔗株系只有少量萎蔫，多数叶片呈现出新鲜绿色（图4）。转pPST2a：1-SST基因甘蔗的株系在干旱胁迫后的表现最佳，转rbcs：1-SST基因甘蔗株系次之，未经转化的甘蔗株系最差。证明根部特异性启动子pPST2a在根中的特异性表达更有利于植株度过干旱逆境。

2.3.2 逆境相关生理生化指标结果 从图5可知，未受干旱胁迫时，各株系间生理生化指标差异不显著，但经过干旱胁迫后，转pPST2a：1-SST基因各株系的SOD酶活性显著高于转rbcs：1-SST基因各株系，未经转化的株系抗氧化物酶活性最低；转基因植株的相对电导率（表示原电导值占总电导值的百分比，其中，样品材料即叶片与去离子水的混合物，室温下静止2 h后测得的电导值为原电导值；煮沸15 min后，温度降至室温，在涡旋混合器上震荡1 min后，测得的电导值为总电导值）均显著高于未经转化的植株，而转pPST2a：1-SST基因植株与转rbcs：1-SST基因植株间差异不显著；转pPST2a：1-SST基因各株系的离体叶片保水率（自由水占总含水量的百分比）显著高于转rbcs：1-SST基因的各株系，未经转化株系的离体叶片保水率最低。

3 讨论与结论

本研究将参与果聚糖合成的蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶基因即1-SST基因，与根部特异性表达启动子pPST2a组合，用农杆菌介导法遗传转化导入甘蔗中，观察转基因甘蔗的抗旱性。结果表明，在干旱胁迫下，未经遗传转化的甘蔗植株的膜脂可能发生了过氧化作用，加剧活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和富集，这些有毒害作用的分子破坏了膜结构和生物大分子，并且通过受损伤的膜渗透细胞内溶物质，造成质膜的通透性增加，进而导致了大量的电解质外渗[3]。相比之下，转pPST2a：1-SST基因甘蔗植株在一定程度上所受到的伤害较小。果聚糖能维持脂质体在温度变化和干旱条件下相态的改变，脂类相态的改变可提高膜的通透性，修复胁迫对膜的损害[14]。1-SST基因编码的低聚合度果聚糖的积累与转基因甘蔗抗旱性的提高有关，这与SacB基因编码的高聚合度果聚糖通过促进根的生长来提高植物抗旱性的实验结果相一致[13-14]。

植物根部在抗旱及耐盐性上有重要的作用，本研究通过2种不同启动子驱动下的转1-SST基因甘蔗的抗旱性比较实验，证实在干旱条件下，转pPST2a：1-SST基因各株系与转rbcs：1-SST基因各株系相比，更能减少水的流失，更有效地提高了抗氧化物酶的活性，从而使转pPST2a：1-SST基因甘蔗植株获得更高的抗旱性；根部特异表达启动子pPST2a驱动下1-SST基因的转化甘蔗的抗旱性及耐盐性得到进一步的提高。说明在缺水条件下，根部特异性表达启动子pPST2a驱动的转1-SST基因甘蔗在干旱逆境胁迫中更能稳定的顺应、度过干旱逆境，同时证实了该转基因方法在甘蔗新品种培育中具有潜在的应用性。

参考文献

[1] 王勤南， 刘少谋， 金玉峰，等. 甘蔗成熟期不同节间与全茎秆锤度的相关性分析[J]. 中国糖料， 2009（1）： 18-20.

[2] Holmberg N， Bülow L. Improving stress tolerance in plants by gene transfer[J]. Trends Plant Sci， 1998， 3（2）： 61-66.

[3] Chen T H H， Murata N. Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of betaines and othercompatiblesol

utes[J]. CurrOpin Plant Biol， 2002， 5（3）： 250-257.

[4] Pilon-Smits E A H， Ebskamp M J M， Paul M J， et al. Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress[J]. Plant Physiol， 1995， 107（1）：125-130.

[5] Pilon- Smits E A H， Terry N， Sears T， et al. Enhanced drought resistance in fructan-producing sugar beet[J]. Plant PhysiolBiochem， 1999， 37（4）： 313-317.

[6] 刘伟华， 赵秀振， 梁 虹，等. 枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因转化小麦的研究[J]. 中国农业科学， 2006， 39（2）： 231-236.

[7] 张 慧， 董 伟， 周骏马， 等. 果聚糖蔗糖转移酶基因的克隆及耐盐转基因烟草的培育[J]. 生物工程学报， 1998， 14（2）： 181-186.

[8] 高 峰， 高 强， 岳桂东，等. 小盐芥（Thellungiella salsuginea）CBF1基因的克隆[J]. 山东大学学报（理学版）， 2005， 40（5）： 113-118.

[9] 李慧娟， 尹海英， 张学成，等. 转蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性[J]. 山东大学学报（理学版）， 2007， 42（1）： 89-94.

[10] 叶兴国， 高 翔， 佘 茂，等. 小麦中果聚糖合成酶基因与抗旱性关系及其分子生物学研究[C]. 全国植物分子育种研讨会摘要集， 2009： 157-158.

[11] 张树珍， 王文治， 马滋蔓， 等. 甘蔗根特异表达启动子及其用途： 中国， 201010184837. 4[P]. 2011-01-19.

[12] 李 玲， 李娘辉， 冷佳奕，等. 植物生理学模块实验指导[M]. 北京： 科学出版社， 2009： 76-100.

[13] Khanna-Chopra R， Sinha S K. Prospects of success of biotechnological approaches for improving tolerance to drought stress in crop plants[J]. Current Science， 1998， 74（1）： 25-34.

[14] Livingston III D P， Hincha D K， Heyer A G. Fructan and its relationship to abiotic stress tolerance in plants[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2009， 66（13）： 2 007-2 023.

责任编辑：古小玲