胡椒叶抗氧化物质提取条件初探

张水平等

摘 要 采用系统溶剂提取法处理胡椒叶，确定了胡椒叶的乙醇提取相和水提取相具有较强的DPPH自由基清除能力和较高的多酚含量；通过对胡椒嫩叶、完全稳定叶和老叶的乙醇和水提取液的DPPH自由基清除能力和多酚含量的测量，得出胡椒嫩叶的多酚含量较高，抗氧化活性较高，老叶次之；采用不同浓度的乙醇水溶液常温搅拌浸提胡椒老叶，得出50%左右的乙醇水溶液提取液具有较强的清除自由基能力，较高的多酚含量（5.4 g/100g）和黄酮类化合物含量（0.8 g/100g）。

关键词 胡椒叶；抗氧化；DPPH自由基；多酚；黄酮类

中图分类号 TS207.3 文献标识码 A

Primary Exploration of the Extraction Conditions of the

Antioxidant from Piper nigrum Linn. Leaves

ZHANG Shuiping1，2， GU Fenglin1，3，4 *， WU Guiping1，3，4， HE Shuzhen1，3，4， WANG Qinghuang1，3，4

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

3 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture，

Wanning， Hainan 571533， China

4 National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract It was ascertained that the ethanol extraction phase and the water extraction phase possess the stronger activity of the DPPH free radical scavenging capacity and the higher levels of polyphenol content by the way of the system solvent extraction. It was concluded that older leaves had stronger antioxidant activity by comparing DPPH free radical scavenging capacity and polyphenol content of the tender leaves， the complete stability lobe and the old leaves. The solution from extraction using 50% ethanol water had stronger activity of free radical scavenging capacity and higher levels of polyphenol content（5.4 g/100g）and flavonoids content（0.8 g/100g）through room temperature agitation leaching using ethanol water with different concentration.

Key words Piper nigrum L. leaves； Antioxidant activity； Free radical scavenging activity； Polyphenolic； Flavonoids

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.019

胡椒（Piper nigrum L.），一种辛辣调味品，是印度传统医学广泛应用的香辛料药物之一[1]，而且在泰国的生药市场上可以买到胡椒的叶和茎，说明当地人已经用胡椒叶来治疗某些疾病[2]。另外同属胡椒科胡椒属的蒟（蒌叶）也有食用途径，一是制作调味品蒟酱，二是取叶与槟榔一起嚼食[3]。Agbor等[4]研究发现胡椒叶的甲醇提取物具有显著的抗氧化活性和抗动脉粥样硬化功能，本课题组前期研究结果表明，胡椒叶比胡椒果具有更强的抗氧化活性[5]，所以胡椒叶可能具有潜在的开发应用价值。

福林酚试剂测量总酚是研究天然产物抗氧化活性的常用方法，它方便、简单并且重现性好[6]；DPPH自由基清除能力的测定方法由Blois建立[7]，在活性物质抗氧化能力测定方面得到了非常广泛的应用[8]。本研究就海南省广泛种植的印尼大叶种胡椒的叶片，以DPPH·清除能力、多酚含量和黄酮类化合物含量为指标，选择较为适合的胡椒叶片及提取方法，为胡椒叶的功能食品类或食品添加剂类的开发利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

完全稳定胡椒叶 2012年12月10日采自中国热带农业科学院香料饮料研究所基地，真空冷冻干燥粉碎待用；不同成熟度胡椒叶[9][嫩叶、稳定叶①、稳定叶②、稳定叶③（编号越大叶龄越大）和老叶]2013年3月21日采摘于中国热带农业科学院香料饮料研究所基地，真空冷冻干燥粉碎待用。

DPPH、福林酚试剂（美国Sigma公司）；没食子酸和芦丁（纯度92.5%）（中国药品生物制品检定所）；无水三氯化铝（AR）（广东光华化学厂有限公司）；其它试剂（广东省汕头市西陇化工厂）。

FD-2真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；QE-300g高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；specord 250plus紫外可见分光光度计（德国analyticjena公司）；天平RMPUT industry electronic balance；RV10旋转蒸发仪digital IKA；MB45快速水分测定仪OHAUS；MS3 basic漩涡混合器（德国IKA公司）；Z36HK全能台式高速冷冻离心机（德国Hermle公司）；HJ-4恒温磁力加热搅拌器（金坛市宏华仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 系统溶剂提取物制备 参考戴冰等[10]系统溶剂法提取工艺研究，并做适当调整。称取50 g稳定胡椒叶粉末，加入1 000 mL石油醚（bp60～90 ℃），常温搅拌浸提10 h，过滤得浸提液于50 ℃下旋转蒸发出大部分有机试剂后，转移出来于50 ℃烘箱中干燥得L1；过滤所得残渣中加入同样体积乙酸乙酯同以上方法得L2；乙酸乙酯过滤所得滤渣同样方法用无水乙醇浸提得L3；最后在残渣中加入1 000 mL高纯水浸提10 h ，70 ℃旋转蒸发，真空冷冻干燥得L4。L1、L2、L3和L4存放在-23 ℃冰箱内待用。

1.2.2 不同成熟度胡椒叶提取液制备 提取液制备方法参考CELL BIOLABS，INC公司产品——OxiSelectTM Oxygen Radical Antioxidant Capacity（ORAC）Activity Assay的试剂盒产品手册，产品编号为STA-345，并做适当改动。称取一定质量冻干胡椒叶粉碎，过20目筛，称取1.0 g粉末，加入20 mL乙醇旋流震荡30 min，12 000 ×g、4 ℃下离心10 min，转移出上层液，定容至50 mL；残渣加入20 mL高纯水，震荡使充分混合，12 000 ×g、4 ℃下离心10 min，转移出上层液，定容至50 mL，得提取液。

1.2.3 老叶的不同浓度乙醇水溶液的浸提液 参考Giorgia Spigno等[11]提取葡萄皮中酚类物质的方法并做适当调整。乙醇浓度分别为0、20%、40%、60%、80%和100%的高纯水溶液常温搅拌浸提4 g胡椒粉10 h，料液比1 ∶ 20（g/mL），过滤后定容至100 mL。

1.2.4 清除DPPH自由基能力的测定 参照文献[12]的方法，略加调整。用无水乙醇制备浓度为1.0 mmol/L的DPPH自由基母液，使用时稀释为0.2 mmol/L的溶液。用各自的提取溶剂把L1、L2、L3和L4配成0.3 g/mL的溶液作为样品检测。DPPH溶液与提取液等体积混合记为As，DPPH溶液与提取溶剂等体积混合为空白记为Ao，乙醇与提取液等体积混合为样品对照记为Ax，以溶剂做参比。充分振荡混合均匀，然后避光反应30 min，之后在517 nm下测量吸光度。DPPH自由基清除率、总清除能力计算公式如下：

DPPH自由基清除率/%=×100

1.2.5 提取物中多酚含量的测定 参考GB/T 8313-2008中的方法二。以没食子酸标准曲线作为定量标准，相同质量原料提取液的多酚含量表示为每100 g干重原料中没食子酸当量克数（g/100g）；用各提取溶剂把L1、L2、L3和L4配成0.3 g/mL的溶液作为样品检测。

1.2.6 提取物中总黄酮含量的测定 参考Francis M Awah等[13]的方法并做稍微改动。具体如下：100 μL的提取液2 结果与分析

2.1 系统溶剂提取液抗氧化能力比较

图1表示胡椒叶系统溶剂提取物对DPPH自由基清除能力的强弱，自由基清除率越高，清除能力就越强。由图1可知，乙醇提取物清除自由基能力最强，水提取物清除自由基能力次之；石油醚和乙酸乙酯提取物清除自由基能力最弱，且两者没有显著性差异。图2表示胡椒叶系统溶剂提取物中多酚含量的高低。由图2可知，乙醇提取物多酚含量最高，水提取物的多酚含量次之；石油醚和乙酸乙酯提取物多酚含量最低，且没有显著性差异。

以多酚含量为自变量，DPPH自由基清除能力为因变量进行回归分析得y=21.461x+22.693，R2=0.830 3，可知拟合度并不高，且二者的皮尔逊相关系数r=0.911 18，P=0.088 8>0.05，说明二者的相关性不存在统计学意义，这可能是因为提取物中还含有非酚类的抗氧化物质。

2.2 不同成熟度胡椒叶的抗氧化能力比较

由图3可知，老叶醇提物清除自由基的能力最强，而嫩叶最弱；但由图4可知，嫩叶水提物清除自由基的能力最强，而老叶和稳定叶③次之。

由图5可知，醇提部位老叶多酚含量最高，嫩叶多酚含量最低；由图6可知，水提部位多酚含量嫩叶最高，老叶多酚含量最低。5种成熟度的胡椒叶片总多酚含量为嫩叶（5.6±0.200）g/100g、老叶（4.0±0.259）g/100g、稳定叶①（3.2±0.225）g/100g、稳定叶②（2.8±0.075）g/100g和稳定叶③（2.9±0.067）g/100g。

醇提部位自由基清除能力与多酚含量回归分析得：y=50.299x-14.476，R2=0.937 1，说明二者具有较高的拟合度，二者的皮尔逊相关系数为0.968 04，P=0.006 8<0.01，二者存在显著的正相关关系；对二者进行水提部位自由基清除能力与多酚含量回归分析得：y=16.457x+6.280 3，R2=0.901 5，说明二者具有较高的拟合度。二者的皮尔逊相关系数为0.949 47，P=0.013 5<0.05，这是因为酚类物质是天然产物中主要的抗氧化物质[15-16]，其酚羟基具有强烈的终止自由基的能力[17]。

2.3 老叶的不同浓度乙醇水溶液浸提液抗氧化能力比较

由上述2.1可知，胡椒叶片的醇提物和水提物都有较强的清除自由基能力，所以对不同浓度的乙醇水溶液提取物清除自由基的能力进行了比较。由图7可知，当提取液的浓度较高时，40%和60%的乙醇提取液清除自由基的能力没有显著性差异，进一步稀释提取液进行检测，由图8可知，40%的乙醇提取液清除自由基的能力最强。由图9和图10可知，40%和60%的乙醇提取液的多酚含量和黄酮类化合物的含量都是最高的，而且提取液中的黄酮类化合物可能主要为黄酮苷或极性较大的黄酮苷元[18]。

多酚含量和黄酮类物质含量的回归方程为y=0.141 5x+0.023 6，R2=0.953 8，皮尔逊相关系数为0.976 60，P=0.000 8<0.001，表明提取液中多酚可能以黄酮类物质为主；多酚含量和清除自由能力的回归方程为y=11.791x-8.673，R2=0.951 7，皮尔逊相关系数为0.975 57，P=0.024 4<0.05；黄酮类物质含量和清除自由能力的回归方程为y=68.127x+0.438 4，R2=0.966 8，皮尔逊相关系数为0.983 27，P=0.016 7<0.05；这说明胡椒叶的水提取液中清除自由基的活性物质是多酚。

3 讨论与结论

本研究通过系统溶剂法提取胡椒叶抗氧化成分，得到胡椒叶内抗氧化成分更易溶于乙醇和水，但是，由于本研究使用的检测方法更适合极性较大的抗氧化物质的检测，所以，石油醚浸提部位和乙酸乙酯浸提部位中也可能存在脂溶性的抗氧化物质有待进一步研究。

胡椒叶片是胡椒主要营养器官之一，它所含的化学物质随叶位、叶龄而异[9]。本研究通过对胡椒不同成熟度的胡椒叶的抗氧化能力比较，得出胡椒老叶和嫩叶可能含有较多的水溶性和醇溶性的抗氧化物质，陈明等[19]也报道嫩叶和成熟叶在酚类物质含量和抗氧化活性方面有显著的区别，其中嫩叶的多酚含量较高与本研究是一致的，这可能是因为嫩叶还没有长出富含纤维的叶片支撑组织，从而使得多酚的相对含量较高。且考虑到嫩叶需要为分化的胡椒花芽提供营养，而且对胡椒进行疏叶也可促进胡椒的产量[20]，所以用老叶提取抗氧化物质更有可行性。

通过采用不同浓度的乙醇水溶液对胡椒老叶进行浸提，得出采用50%左右的乙醇水溶液能提出较多的抗氧化成分，其中多酚含量为5.4 g/100g，黄酮类物质含量0.8 g/100g。Francis M Awah等[13]对尼日利亚的7种特定药用植物的的黄酮类物质含量和多酚含量进行测量，数据显示含量较高的分别为0.6 g/100g和7 g/100g；Cai等[21]对112种传统中药植物多酚含量进行了测定，结果得出其平均值为3.5 g/100g左右，通过比较说明胡椒叶中的多酚含量和黄酮类物质的含量处于较高水平，具有开发利用的潜力。

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责任编辑：沈德发