胡椒资源ISSR遗传多样性研究

范睿等

摘 要 利用简单重复序列区间（ISSR）技术分析来自不同国家的56份胡椒种质资源的遗传多态性。结果显示：7条引物共产生141条清晰的谱带，分子量在0.2～3.0 bp之间，多态位点百分率达100%，在一定程度上说明胡椒资源遗传的复杂性和多样性。在相似性系数约为0.51的水平上将56份资源聚为3个类群，与基于ITS的研究结果类似。大胡椒与其它种质的亲缘关系均比较远，显示出其明显的差异性和独特性，与其形态学分类结果一致，同时支持将顶花胡椒、光轴苎叶蒟归入苎叶蒟，光茎胡椒作为一个变种。

关键词 胡椒；种质资源；ISSR标记；遗传多样性

中图分类号 S573.9 文献标识码 A

Genetic Diversity of Pepper Germplasm

Resources by ISSR Markers

FAN Rui， WU Huasong*， HAO Chaoyun， TAN Lehe， WU Gang， YANG Jianfeng

Spice and Beverage Research Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulatioin for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract To assess the genetic diversity of pepper germplasm resources and some taxonomic problems of Piper genus， 56 accessions were analyzed using inter-simple sequence repeat（ISSR）markers. 7 primers were screened from 100 random primers， and a total of 141 fragments were amplified ranging from 0.2～3.0 kb， all of which were polymorphic. The average number of DNA band produced by each primer was 20.1. Based on the dendrogram of UPGMA， 56 accessions could be divided into three groups at the level of 0.51， which was similar to the results of Jaramillo et al. obtained from the studies on ITS sequences. The location of P. umbellatum in the dendrogram showed that it had high level of genetic distance to other accessions， which was similar to the results of morphology and floristic geography. The high degree of correlation among P. boehmeriifolium， P. boehmeriifolium var. tonkinense， P. terminaliflorum and P. glabricaule supported well former researches， and it was reasonable to combine the first three speices into one taxon（P. boehmeriifolium）， and alter Piper glabricaule as a variety. And the phylogenetic relationships of some other species were also discussed.

Key words Pepper（Piper nigrum）； Germplasm resources； ISSR marker； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.016

胡椒（Piper nigrum）为胡椒科（Piperaceae）胡椒属（Piper）多年生木质藤本植物，素有“香料之王”的美誉，既是世界最重要的香辛作物之一，又具有药用价值和工业利用价值，在医学领域可被用作健胃剂、解热剂和支气管粘膜刺激剂等[1-2]，在食品工业上也可用作抗氧化剂、防腐剂和保鲜剂等[3]。据联合国粮食及农业组织统计，2008年世界胡椒收获面积5.53×105 hm2，总产量4.33×105 t，其中中国胡椒主要分布在海南、云南、广东、广西和福建等地，年产量达2.72×104 t，位居世界第五[4]。作物种质资源包括野生近缘种、地方品种、选育品种、育种品系和遗传材料等，蕴藏着各种性状的遗传基因，是品种选育和生物学理论研究的基本材料来源[5]。胡椒野生近缘种资源极为丰富，有超过1 000个植物种类，为胡椒科重要的泛热带组成成分[6-7]，但许多种类外形特征极为相似，给种类准确鉴定造成了困难[8-9]。胡椒地方品种、选育品种和育种品系等资源也较为丰富，地方品种如卡纳瓦利、巴兰哥塔等，各国选育品种如兴热1号、云选1号、班尼约尔、Nedumchola、Vadakkan、73-F-5等，品种遗传背景复杂[10-11]。胡椒种质资源物种多样和形态相似的特点影响了其准确分类鉴定，不利于后续的资源评价与创新利用工作。借助分子技术是解决分类问题最为可靠而快捷的方法。Pradeepkumar等[12]利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA）标记研究了22个胡椒种质的指纹图谱，发现除了班尼约尔-3外，其余种质均扩增得到了特异性谱带；Keshavachandran等[13]也用RAPD研究了17个胡椒品种和12个荜菝品种的指纹图谱，所有种质均可获得特异性谱带，表明该标记可以用于胡椒种质的鉴别。姜艳等[14]开展海南省不同采集地胡椒种质的ISSR遗传多样性分析，但主要是中国海南省内的几个种，种类较少。本研究利用简单重复序列区间（Inter-simple sequence repeat，ISSR）分子标记技术，对来自中国、印度尼西亚、印度、巴西、伯利兹等国家或地区的56份野生近缘种、栽培品种和育种材料进行遗传多样性分析，旨在揭示其亲缘关系，为种质的准确鉴定提供可靠依据，并解决一些种质分类疑问，对今后遗传改良、育种亲本选配、种质保护和核心种质构建等具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

野生近缘种、主栽品种和育种材料共56份，分别引种自东南亚和中南美洲部分国家或地区，其中国内野生近缘种30种，国外野生近缘种9种，主栽品种和育种材料等17份，活体保存于农业部万宁胡椒种质资源圃。详见表1。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取 取植物嫩叶样品约100 mg，利用基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取总DNA。UV-2102型紫外可见分光光度计测定浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳法检测DNA是否降解，浓度稀释为50 ng/μL，备用。

1.2.2 PCR扩增 经不同反应条件扩增对比分析，建立最佳ISSR反应体系及程序[15]。25 uL反应体系：含1×PCR buffer，2 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，2 μmol/L引物，100 ng模板，1 U Taq DNA聚合酶。反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 120 s，复性（据不同引物的退火温度）60 s，72 ℃ 3 min，35个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR产物均用含有DuGreen的1.5%琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳，上样量 5 μL，电压4 V/cm。电泳结束后在凝胶成像系统上检测拍照。

1.3 数据分析

将扩增片段作为显性标记，按照有（1）和无（0）记录电泳谱带，构建原始数据矩阵。应用PopGen32软件包计算Shannon多样性指数、Nei's无偏遗传距离。基于Nei's多样性指数矩阵，采用无权重配对算术平均数法（Unweighted pair group method with arithmatic mean，UPGMA）构建系统关系树，基于ISSR表型数据矩阵进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 扩增产物多态性

从100条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、重复性高的引物7条，对所有样品进行多样性分析。结果显示，7条引物共检测到141个位点，每个引物检测位点数在10～26个之间，平均为20.1个，DNA片段大小分布在0.2～3.0 kb之间（图1），反应中所用引物序列大多富含（GT）n或（TG）n、（AG）n或（GA）n和（AC）n等二核苷酸重复序列（表2），所有条带均具有多态性，多态位点比例达100%。Shannon多样性指数评价样品遗传多样性结果表明：平均多样性指数（I）为0.560 1，每个位点的有效等位基因数（Ne）为0.379 9（表2）。可见，上述胡椒种质资源的多态性条带极为丰富，在一定程度上说明其遗传背景的复杂性和遗传多样性的丰富性。

2.2 遗传相似性系数分析

根据条带矩阵计算Nei's遗传相似性指数，按照UPGMA法生成表征种质间亲缘关系的树状聚类图（图2）。由7条引物扩增带计算得到的56份胡椒种质资源的Nei's遗传相似性指数在0.305～0.933之间变动，平均值为0.574，其中大胡椒（DHJ）与班293（B293）之间的相似性系数最小（0.305），杂交种质柬印43（JY43）与柬印93（JY93）之间最高（0.933）。聚类结果表明，在相似性系数约为0.51水平上可将56份样品聚为3个类群：（1）原产亚洲的胡椒野生近缘种资源，以及栽培品种和育种材料；（2）原产美洲的野生近缘种；（3）广泛分布于东南亚、美洲和非洲的大胡椒。可见，在大的地理范围内，胡椒资源遗传亲缘关系与地理距离存在一定的相关性。

主成分分析可排除重叠和分类意义不大的条带，使重要因素突显出来。特征根大小代表各综合指标对总遗传方差贡献的大小，特征向量表示各性状对综合指标贡献的大小。由表3和图3可见，第1主成分所占信息量仅21.91%，前3个主成分累积贡献率仅有37.58%，直到第8个主成分累积贡献率才达到54.45%，各性状贡献率分散，累积贡献率增长不明显，说明胡椒资源在形成演化过程中基因变异的多方向性和复杂性。

3 讨论与结论

遗传多样性是生物所携带遗传信息的总和，代表该物种在特定环境中基因的丰富程度，是植物选育及研究中最重要与最有价值的物质基础。本研究显示，胡椒种质资源平均Nei's相似性指数仅为0.574，遗传多样性水平极高，遗传变异明显，与以往的研究结果基本一致。如Pradeepkumar等[16]和施江等[17]分别利用RAPD和AFLP标记技术对胡椒栽培种与野生近缘种的遗传关系进行了研究，其中多态位点百分率均高达98%以上，遗传多样性水平极高。对胡椒种质资源遗传多样性极高的现象，分析认为，胡椒属植物多为木质藤本植物，寿命长、雌雄异株、风媒传粉，后代极易产生基因变异，因此其高水平的遗传多样性也不难理解。同时，主成分分析的累计贡献率增长不明显，贡献率分散，说明本类群在演化过程中遗传变异的无规律性，与基于形态表型特征的研究结果基本一致[9]。

作物种质资源包括野生近缘种、地方品种、选育品种、育种品系和遗传材料等，是优异品种筛选和培育的重要性状材料来源，被认为是最有价值和战略意义的物质财富而受到越来越多的重视。目前，关于胡椒野生近缘种遗传多样性与分子系统学已开展了部分研究。由本研究可见，56份胡椒种质可聚为3大分支，亚洲热带进化支、美洲热带进化支以及泛热带分布的大胡椒进化支，与以往研究基本一致。基于核糖体DNA（nrDNA）ITS（Internal transcribed spacers，ITS）序列，发现世界范围内胡椒属植物可形成了三大分支：亚洲热带进化支、美洲热带进化支和南太平洋岛屿进化支，表明胡椒属植物亲缘关系与其地理距离存在相关性[18]。Parthasarathy等[19]应用GIS和聚类分析多样性，结果发现亲缘关系较近的种类常出现在相同或邻近地区，表明在小的区域范围内，该植物类群亲缘关系与地理距离呈较强的正相关。但在亚洲热带进化支内，地理距离较远的种类反而具有较近的亲缘关系，物种相似性并未表现出地域性特征，与以往研究结果存在一定差异，具体原因还有待开展分子系统学等方面的工作。

大胡椒穗状花序多数、通常2-7复作伞形花序式排列，与胡椒属其他物种差异明显，被Willdenow等植物学家列入大胡椒属（Pothomorphe）[20]，而主张大种概念的林奈则将其归入胡椒属。从本文结果看，大胡椒与其他胡椒种质亲缘关系较远，单独聚为一个分支，表现出明显的差异性和独特性。1982版《中国植物志》将苎叶蒟（P. boehmeriaefolium）、顶花胡椒（P. terminaliflorum）、光茎胡椒（P. glabricaule）作为3个物种区别对待，而光轴苎叶蒟（P. boehmeriaefolium var. tonkinense）作为1个变种，后来Gilbert和夏念和[21]等建议将顶花胡椒、光轴苎叶蒟归入苎叶蒟，而光茎胡椒作为变种（P. boehmeriifolium var. glabricaule）。基于本文ISSR标记的聚类结果可见，上述4个种质作为1个小分支聚在一起，其中光轴苎叶蒟与苎叶蒟的Nei's相似性水平达0.843，表现出较近的亲缘关系，支持最新分类结果。球穗胡椒为中国西南部常见种，以叶具暗红色腺体、叶背灰白色、果序短为特征，而腺脉蒟Piper bavinum通常有更长果序和缺少粉白色被毛而与球穗胡椒区别，但后来发现这些差别呈连续性，因此将它们作为一个类群[21]。由本研究结果可知，采自云南的球穗胡椒与采自海南的腺脉蒟在相似性0.741水平上聚在一起，相对于其他物种表现出更近的亲缘关系，但是否能否归入一个类群有待深入研究。

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责任编辑：赵军明