可可种质资源多样性与创新利用研究进展

秦晓威等

摘 要 就可可种质资源在起源、分布、传播、分类、鉴定及种质创新与利用等方面取得的研究进展进行综述。可可属植物有22种，仅可可（Theobroma cacao）和大花可可（Theobroma grandiflorum）用于栽培。可可种质资源多样性丰富，其分类研究经历了传统形态学划分的Criollo、Forastero和Trinitario遗传类群到现代分子标记划分的Maran～on、Curaray、Criollo、Iquitos、Nanay、Contamana、Amelonado、Purús、Nacional和Guiana遗传类群。目前，可可的生产性品种选育仍以实生选种和芽变选种为主。分子标记的开发、遗传连锁图谱的构建和全基因组测序的完成，为实现可可分子标记辅助育种提供了技术保障。

关键词 可可；种质资源；种质创新

中图分类号 S571.3 文献标识码 A

Advances on Germplasm Research and Utilization of

Theobroma cacao L.

QIN Xiaowei1，2，3，4， HAO Chaoyun1，2，3，4， WU Gang1，2，3， LI Fupeng1，2，3， LAI Jianxiong1*

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture，

Wanning， Hainan 571533， China

3 Danzhou Investigation & Experiment Station of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

4 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and

Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract The study explores the advances on the origin， distribution， spreading， collection， classification， identification， genetic improvement and development of cacao germplasm resources. There are approximately 22 Theobroma species， and only T. cacao and T. grandiflorum are cultivated. During the process of domestication and cultivation， abundant genetic diversity of cacao germplasm was revealed by morphological data and molecular markers. Traditionally， cacao types are classified into three main groups： Criollo， Forastero， and Trinitario. However， recent study results showed that there were 10 major groups， such as Maran～on， Curaray， Criollo， Iquitos， Nanay， Contamana， Amelonado， Purús， Nacional， and Guiana by microsatellite marker. This new classification reflects more accurately the genetic diversity. Additionally， most new cacao varieties are selected from seedlings or bud mutation. Recently， molecular markers， high-density genetic linkage map， and the whole genome sequencing have already been widely reported on cacao germplasm， which may be improved breeding efficiency by marker assisted selection.

Key words Theobroma cacao L.； Germplasm resources； Germplasm enhancement

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.033

可可为梧桐科（Sterculiaceae）可可属（Theobroma）常绿乔木，共22种。根据花、果实和相关植物学形态特征，该属分为Andropetalum、Glossopetalum、Oreanthes、Rhytidocarpus、Telmatocarpus、Theobroma 6组[1-2]。其中，仅可可（Theobroma cacao L.）和大花可可（Theobroma grandiflorum）被驯化为栽培物种[3]，迄今有2 000多年的栽培历史。可可种子富黄酮类化合物、脂肪、蛋白质和膳食纤维等活性成分，具有改善心脏、肾脏、肠道功能、缓解心绞痛、促进消化、治疗贫血等保健作用，是制作高级饮品、巧克力、糖果、糕点和冰淇淋等的主要原料[4-5]。目前，世界广泛栽培的可可有Criollo（T. cacao ssp. cacao）、Forastero（T. cacao ssp. sphaeorocarpum）和Trinitario（Criollo×Forastero）3类遗传类群[1，6]。世界可可产量的85%来源于Forastero栽培种，Criollo因其抗病性差，仅占世界产量的1%～2%[7]。另外，Motamayor等[8]鉴定补充了2类传统的栽培品种Nacional和Amelonado，但原产于厄瓜多尔的Nacional种已基本绝迹。

可可作为重要的热带经济作物，种质资源的丰富性一直备受关注。自Pound[9]首次经由厄瓜多尔到亚马逊河流域和哥伦比亚开展抗可可丛枝病种质资源调查以来，世界可可主要栽培区陆续进行种质资源普查工作，相继建立了10多个国家级和3个国际级种质资源保存中心[10-12]。据英国雷丁大学开发管理的国际可可种质资源数据库（ICGD）统计，至2012年已记录可可种质29 500份，在产量、果实、种子性状、抗病性、配子体兼容性、株型及花结构等方面表现出丰富的遗传变异性，但约有44%的材料重名（www.icgd.reading.ac.uk）。因此，如何快速、准确、有效地鉴定种质资源成为可可研究的核心问题。笔者就可可种质资源在起源与分布、分类与鉴定及创新利用等方面取得的研究进展进行了总结和分析，以期为其进一步研究利用提供参考。

1 可可起源、分布与传播

1.1 可可起源与分布

可可是一种驯化时间相对较短的物种，为二倍体（2n=20）。“cacao”一词衍生于玛雅人纳瓦特尔语“cacahuatl”。植物学家林奈根据土著人的神圣信仰，将可可树命名为“Theobroma cacao L.”，意味着“可可——众神的食物”。据史料记载，中美洲是世界上最早栽培可可的地区，栽培历史超过2 000多年[1]。截至2011年，世界可可收获面积达9.9×106 hm2，产量约4.6×106 t，其中，主产国科特迪瓦占总产量的29.4%，其次为印度尼西亚（19.1%）、加纳（14.9%）、尼日利亚（10.1%）、喀麦隆（6.2%）、巴西（5.5%）和厄瓜多尔（3.1%）[13-14]。作为重要的热带经济作物，过去人们依据地理起源和形态特征，将可可分为Criollo和Forastero两大遗传类群[15]。然而，关于可可起源与分布的假说各抒己见。以Hunter和Leake[16]为代表的“南-北散布假说”认为可可起源于南美洲亚马逊河流域安第斯山脚下的厄瓜多尔与哥伦比亚边界，由人为活动将Criollo种子传播至中美洲。相反，Vavilov[17]主张的“北-南散布假说”则认为中美洲Criollo遗传类群起源于尼加拉瓜湖的最南部，后被印第安人传入南美洲种植[18]。而Nava[19]则主张可可具有广泛的自然地理分布，该假说认为大量的Theobroma cacao L.群体由中美洲地区向墨西哥南部散布，受巴拿马地峡地理隔离的影响，分化出中美洲的Theobroma cacao ssp. cacao和南美洲的Theobroma cacao ssp. sphaeorocarpum亚种；第1个亚种包含Criollo遗传类群，第2个亚种包含Forastero遗传类群。经典的地理隔离模型及亚种间的种间杂交试验均能支持该假说[1-2]。

然而，许多人类学、历史学、考古学和生物地理学的证据及遗传群体的研究均在一定程度上支持“南-北散布假说”[20-21]。在此基础上，Dias[22]提出可可起源与分布的新假说：在前哥伦布时期，假定亚马逊河上游和奥里诺科河盆地存在一个相对广泛的可可起源中心，Criollo和Forastero遗传类群由人为活动沿着安第斯峡谷传入中美洲。在玛雅帝国时期，人类有意识的选择高品质巧克力制品材料Criollo遗传类群，而疏忽了亚马逊Forastero群体的灭绝。Dias的新假说拓展了物种保护与遗传改良对物种进化过程重要影响的理解。

1.2 可可种质资源的传播

可可在世界范围内的传播始于西班牙殖民主义。克里斯托弗·哥伦布为寻找通往印度的航海线路，1502年到达尼加拉瓜，是首位接触到可可的欧洲人[23]。当时，可可豆在中美洲一些地区被作为流通货币使用。1519年，西班牙探险家荷兰科尔·蒂斯在墨西哥的阿兹特克帝国发现一种xocoatl饮品（巧克力饮料），于1528年带回西班牙，并在西非一个小岛上种植可可[23-24]。可可饮品在欧洲的盛行，促使西班牙、法国、荷兰等殖民者在其殖民地如多米尼加共和国、特立尼达、海地等地区种植可可[25]。1560年，西班牙人将可可从委内瑞拉的首都卡斯卡斯引入印度尼西亚的苏拉威西岛，相继传入菲律宾。17世纪20年代，荷兰人接管库拉索岛种植业，并于1778年从菲律宾引种可可至印度尼西亚和马来西亚。17世纪60年代，法国人也将可可陆续带到马丁尼克岛、圣卢西亚、米尼加共和国、圭亚那和格瑞纳达等地区[26-27]。至1680年，马丁尼克的加勒比海岛成为主要的可可生产地之一。17世纪70年代，英国人将该作物引入牙买加。至18世纪中叶，可可由巴西北部的帕拉河引种栽培至巴伊阿。可可制品在欧洲国家市场的需求过剩，致使可可种植业持续扩张。19世纪初，可可被引至普林西比岛（1822）、圣图美（1830）和非南多波（1854）等非洲地区。此后，经由南非非南多波岛传入尼日利亚（1874）和加纳（1879），又至象牙海岸（1905），该地区成为世界最大的可可生产国[27]。在喀麦隆，可可引种栽培是在1925～1939年的殖民时期[28]。中国可可引种历史相对较短，1922年首次由印度尼西亚和爪哇地区引入台湾嘉义、高雄等地种植[29]。20世纪50年代，中国先后从越南、泰国、马来西亚、印度尼西亚、科摩罗、厄瓜多尔、巴西等10余个国家引进可可种质。目前，主要栽培于海南、台湾地区，云南、广东、广西、福建等地也有零星引种种植[30]。

2 可可种质资源遗传多样性研究

2.1 表型水平多样性

表型标记是可可种质资源遗传多样性研究最为原始而直观的鉴定方法，建立一份国际规范的可可基本信息描述数据库是遗传信息交流、编制种质资源目录、培育新品种、简化管理和维持种质收集的基础。Engels等[31]针对可可种质资源描述规范，编制了87项数量和质量性状描述列表，该列表为国际植物遗传资源委员会（IBPGR）可可种质描述标准的基础[32]。同时，Engels[33]通过对其种质的花、果实和相关形态特性研究，揭示出可可种质存在Criollo与Forastero两大类遗传类群及其杂交种Trinitario。之后，NGoran[34]针对可可果实和种子性状特征进行研究，证实Criollo和Forastero遗传类群因种间遗传杂交的发生而可继续划分。另外，生殖性状，如花性状特征因在进化过程中受较大选择压力的影响，在分类上表现的比营养生长更有利，是可可种质资源描述鉴定的主要特征。Enriquez和Verified曾利用花性状对南美洲67种可可栽培种进行描述与编目，现被广泛用来鉴定可可栽培种的变异性[35]。类似地，Bekele和Bekele[36]采用54项表型性状描述了ICGT的100多份种质，Quiroz 和Soria[37]采用38项花、果实、种子性状对‘Nacional种质进行鉴定。为简化形态学标记的繁琐指标，Dias等[38]利用多元统计方法筛选出13项表型指标对15份SIC和11份SIAL群系进行表型差异分析。Efombagn等[32]通过对喀麦隆收集保存的300份农家型种质和77份基因库种质的表型遗传多样性分析，筛选出17项重要的有效描述指标。然而，由于种质的鉴定和评价是一项单调、乏味、且非常昂贵的项目，其工作的间断性及众多指标在实际的应用中很少被考虑、或大量的材料种植在大田等问题，使得该项的工作变得非常困难。因此，表型性状指标的筛选与优化成为可可种质鉴定、评价的一个难点。

2.2 细胞水平多样性

染色体标记主要包括核型、染色体带型和原位杂交及染色体的数目和结构变异等，它们均能准确的反映植物体内出现的细胞水平多样性。可可属22个种中仅可可的子叶为紫色，其余均为白色子叶，这为研究可可栽培种与野生种间的系统发生关系提供依据。染色体倍性的研究结果表明，该属所有种均为二倍体（2x=2n=20），染色体形态相似，长度变异范围为0.5～2.0 μm[39]。然而，除可可外，可可属其余种间和种内的遗传多样性几乎没有被评估[22]。近期，Dantas和Guerra[40]研究了可可属中最重要的2个物种可可和大花可可有丝分裂过程中染色体的变化规律，其染色体均为对称型核型，染色体长度变化范围分别为1.19～2.00 μm和1.15～2.21 μm，臂率分别为1.12～1.32和1.10～1.30。此外，Couch等[41]采用复性动力学方法测得可可基因组大小变异范围在390～415 Mb，其染色体较小，有一条次缢痕，缺乏C-带。而Guiltinan等[42]利用荧光流式细胞术测得可可基因组大小为447 Mb±11 Mbp 2C。这些研究结果均表明，可可基因组大小与先前研究的温带和热带植物相比是很小的，这在一定程度上使得可可基因组学的某些方面研究，如全基因组测序成为可能。

2.3 分子水平多样性

分子技术可以从根本上揭示植物内在的基因差异，为可可种质资源遗传多样性和准确鉴定注入了新活力。许多研究发现，与同工酶标记相比较，RAPD标记能够产生足够多的标记来挖掘可可种质资源的序列多态性。Sounigo等[43]利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA）标记研究了可可主栽品种和野生近缘种的指纹图谱，几乎所有种质均获得特异性谱带，并发现可可栽培种之间的遗传背景十分狭窄。Motamayor和Lanaud[44]利用RAPD、AFLP、SSR标记解决了Criollo、Forastero和Trinitatio可可遗传类群的起源、分布及传播等问题。AFLP技术在可可种质指纹图谱研究中也进行了成功应用[45]。SSR、ISSR标记在辅助可可种质资源的收集和评估方面，体现出快速、简单和重复性高的优点[46]。Borrone等[47]、Riju等[48]、Fouet等[49]通过EST-SSR功能性标记的开发和利用研究证实，EST-SSR标记在可可遗传多样性分析、遗传图谱构建以及比较基因组等研究方面有广阔的利用前景。

分子标记已成为解决种质重复和错误鉴定的重要手段[50-52]。Motilal和Butler[53]的研究结果表明，基于形态学鉴定的可可种质错误率高达15%～44%。Figueira等[54]对11份可可种质取样分析发现，在巴西可可种植计划执行协会和马来西亚巴尔种植园保存的ICS6和SIAL93是同物异名种质。马来西亚收集的SIAL93种质来源于美国波多黎各的一种IMC67×PA218砧木枝条，因该砧木生长旺盛而被当作SIAL93接穗错误采集。类似情况在巴西从马亚圭斯引种SIAL93时也发生，该材料被重新命名CEPEC533。之后，Charters和Wilkinson[55]通过ISSR分析证实SIAL93被鉴定错误。另外，Motamayor等[15]利用SSR标记快速矫正了23.3%的错误鉴定可可种质，区分了在形态学上难以鉴定的2类遗传类群，并将952份种质划分为Maran～on、Curaray、Criollo、Iquitos、Nanay、Contamana、Amelonado、Purús、Nacional和Guiana 10大遗传类群，为可可种质的精准鉴定提供了有益参考。因此，分子标记的应用可澄清同物异名或同名异物材料，并为种质遗传多样性提供了新的见解。

3 可可种质资源创新与利用研究

3.1 可可传统育种研究

可可种质资源创新研究主要集中在美洲大陆、加勒比、亚洲、大洋洲以及非洲等地区，受经济发展水平等多种因素综合影响，近几十年来可可种质资源创新利用滞后，选育种工作未取得明显进展。在巴西，可可种植户通过混合筛选获得var. Comum、var. Pará、var. Parazinho和var. Maranha～o 4个新品种。在此基础上，巴亚州可可研究所对可可产量及构成因素的遗传性状进行研究，筛选出SIC、SIAL和EEG等高产品系，还发掘出一些白色籽粒的突变株，如Catongo。目前，巴西可可种植计划委员会利用传统杂交育种手段，获得高产、抗丛枝病新品种Theobahia（Sca-6×ICS-1）、Theobahia 1（Sca-6×ICS-6）和Theobahia 2（Sca-6×ICS-8），但因Theobahia 1和Theobahia 2易感长喙枯萎病（Ceratocystis wilt）而被撤回。在厄瓜多尔，虽然从Nacional遗传类群中筛选出具有独特品质的arriba品种，但受特立尼达育种计划的影响，Trinitario遗传类群仍是其种质创新的主要材料[56]。近年来，马来西亚农业种植部在可可选育种工作取得显著成效，其UIT1×NA33和Pa7×Na33无性系具有高产、优质、高抗病等特点，平均年产量达2 500 kg/hm2，特别是Pa7×Na33品系对维管条纹回枯病具有很强的抗性。另外，巴布亚新几内亚的Efron等[57]利用Trinitario遗传群体，通过特异砧木筛选获得SG2-B和SG2-S无性材料。在非洲，科特迪瓦国家农业研究中心利用Forastero和Trinitario杂交获得新品种UF-667和UF-676，同时开展了二倍体杂交育种，但由于单倍体发生频率低、研究费用过于昂贵而中止[43]。同时，加纳、特立尼达、喀麦隆、印度尼西亚等也开展了一些可可选育种工作[27]。20世纪70年代以来，中国热带农业科学院香料饮料研究所利用混合筛选技术，筛选出高产、耐寒种质热引4号，并发掘出I-H-6、I-H-18等高产、高质种质8份，现推广种植于海南、云南、台湾等地。

3.2 可可分子辅助育种研究

可可重要性状的分子标记开发、高密度遗传连锁图谱的构建和全基因组测序的完成为可可全基因组范围内的分子标记辅助育种提供了技术保障[58-59]。Crouzillat等[60]利用RAPD和RFLP分子标记构建了可可的分子标记遗传图谱，对单株年产量及其构成因素（果实数量、果实指数、种子指数、每个果实种子数等）进行QTL定位分析，确定其在染色体上的位置及其遗传效应。同时，Clement等[61]选用Forastero（IMC78）、Trinitario（DR1和S52）的侧交后代为材料，利用RFLP、SSR、AFLP标记技术对可可籽粒性状进行QTLs定位，共检测到QTLs 27个，分布于1、2、4、5、9和10号染色体上。单个QTL解释性状表型变异的4.9%～22.3%。然而，目前大量的研究主要集中在可可抗病性的分子辅助育种研究。据统计，可可病害每年造成约81 000 t的产量损失（约占世界产量的30%），个别种植户损失达100%[62]。因此，可可抗病性研究成为可可育种家的核心任务，而分子标记的应用为有效获得丰富的抗病性材料提供了技术手段[12，27]。Silva和Marita分别找到了可可丛枝病抗性的RADP分子标记，有些抗性分子标记已成功的应用到抗病育种中[27]。在印度，利用AFLP分子标记和ITS序列分析已在区分可可疫霉病菌种类方面取得突破性进展[63]。另外，Brown等[64]用可可易感丛枝病品系ICS1和高抗品系Sca6为亲本，以ICS1×Sca6的F2分离群体为材料，利用170个SSR标记和12个候选基因构建总长为617.9 cm分子遗传连锁图谱，检测到2个抗病QTL位点。在可可黑果病和荚果霜霉病研究方面，哥斯达尼加热带农业调查与教学中心利用180个SSR标记引物检测抗黑果病品系Pound 7和抗荚果霜霉病品系UF 273杂交后代F1群体的256个单株标记基因型，获得5个抗荚果霜霉病和3个抗黑果病的QTL位点[65]。这些研究结果表明，分子标记技术对抗病基因的准确定位，可为培育具有持久抗性的品系或品种提供新思路，在实践和理论研究上都具有重要意义。

4 研究展望

可可种质资源作为维持其产业健康发展的源头，深入的开展调查、收集、保存、鉴定和评价研究是提升可可种质保护、创新与利用的关键。但许多研究仅停留在形态学观察、描述及简单的分子标记分类上，与其它大宗作物相比，研究相对滞后。因此，为充分开发利用及合理保护现存的可可种质资源，其研究工作可在以下方面加以开展：

（1）加强可可种质资源的考察收集与引种研究。可可属内有22个种，如T. cirmolinae、T. glaucum和T. mammosum等，目前仅可可和大花可可用于栽培，尚有15种具有开发应用前景。哥伦比亚、巴西、哥斯达尼加等地区分布着大量的可可自然居群和携带各种抗性基因的优异种质。然而，我国可可资源相当匮乏，为促进可可种质资源的创新与利用，需要加强资源的收集和优异种质的引进。

（2）建立完善的可可种质资源鉴定、评价体系。可可种质资源遗传多样性研究经历了形态学、细胞学和分子水平的独立发展阶段，而这些鉴定类别之间缺乏有机的统一。甚至，鉴定结果间差异较大。尽管各种鉴定均在一定程度上体现出遗传资源的丰富程度，但在揭示种质资源宏观水平的表型变异在微观分子水平上的关联时却缺乏直接的依据。此外，可可作为世界三大饮料作物之一，品质是决定价格和市场竞争力的关键因素。目前，可可种质品质评价一般根据农艺性状和部分成分的含量来确定，尚缺乏对其功能性成分的信息物质或分子指纹、化合物结合态及功能结构等方面的精细鉴定。因此，构建一个合理的、规范的、系统的可可种质资源鉴定、评价体系亟待开展。

（3）可可种质创新利用与新品种选育工作有待进一步加强。可可是异花授粉作物，在遗传上高度杂合，多数主产国以种子繁殖为主，F1代强烈分离，提高早期选育效率和准确鉴定目标性状成为可可育种家关心的重要问题。利用分子标记与目标性状间的紧密连锁关系对性状进行辅助选择，为可可分子辅助育种的研究提供新的思路。基于连锁不平衡的关联分析一般以自然群体为材料，将目标性状变异与基因多样性结合，可直接鉴定出表型变异相关的基因位点或标记位点，以及对目标性状有正向贡献的特异等位变异。因此，在收集保存大量种质资源基础上，利用关联分析检测与目标性状显著关联的基因位点，发掘特异等位变异载体，可为可可重要基因克隆和分子育种提供基础资料。

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