小白菜RING锌指蛋白基因的克隆及其表达分析

赵瑞丽等

摘 要 锌指蛋白在调控植物防御和抗性方面具有重要作用。根据从小白菜中获得的与铜胁迫相关的RING锌指蛋白基因TDF片段设计引物，应用RACE技术克隆出具有完整阅读框的小白菜RING锌指蛋白基因，该基因全长855 bp，开放阅读框606 bp，编码202个氨基酸，分子量为21.32 ku，理论等电点为6.87，属于中性蛋白。结构分析结果表明，该蛋白C-端含有1个保守的C3HC4型RING锌指结构域。进化树分析结果显示，小白菜RING锌指蛋白与芜菁RING锌指蛋白的相似度高达98%，属于C3HC4型RING锌指亚家族。RT-PCR分析结果表明，在铜胁迫下该基因下调表达，推测其可能参与对铜胁迫的应答反应。此结果为进一步研究该基因在小白菜逆境应答中的作用机制奠定基础。

关键词 小白菜；RING锌指蛋白基因；RACE；RT-PCR

中图分类号 S634.3 文献标识码 A

Cloning and Expression Pattern of a RING Zinc Finger

Protein Gene in Brassica chinensis L.

ZHAO Ruili， ZHONG Fenglin*， LIN Junfang， GAO Shichao，

HU Haifei， YANG Biyun， LIN Yizhang*

College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University Fuzhou， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract Zinc finger protein plays a key role in the regulation expression of plant defense and response. The primers were designed according to the transcript derived fragments. The 855 bp full length cDNA of RING zinc-finger gene was isolated by rapid amplification of cDNA ends（RACE）， including a 606 bp open reading frame encoding 202 amino acid residues. The molecular weight of deduced protein is 21.32 ku with a theoretical pI of 6.87. The protein has a C3HC4-type RING finger domain and blongs to C3HC4-type Zinc-finger subfamily. Phylogenetic analysis showed that RING zinc-finger gene had 98% similarity with Brassica rapa. Real-time PCR revealed that the expression of RING zinc-finger gene was down-regulated in copper stress， suggesting that it might response to copper stresses. The results would be useful in the study of its functions and mechanism in copper stress responses of Brassica chinensis L.

Key words Brassica chinensis L；RING zinc finger protein； RACE；RT-PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.015

小白菜（Brassica Chinensis L）是十字花科芸薹属植物，其营养价值较高，栽培面积较广，是备受人们喜爱的蔬菜之一。近年来，随着含铜农药、化肥的使用，土壤中铜含量越来越高，严重影响了小白菜的产量和品质。

RING锌指蛋白（RING zinc finger protein）是一类能够与2个Zn2+结合形成稳定的“指状”结构域的转录因子，根据第5个保守区氨基酸的不同（Cys/His）， RING锌指蛋白可分为RING-HC（C3HC4）和RING-H2（C3H2C3）2种类型[1]。RING锌指蛋白在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育和增强植物抗逆性等过程中起着重要作用[2-4]。许多研究结果表明，RING锌指蛋白能够通过降解花粉管RNA、抑制细胞生长、调控光形态建成、染色质重组等多种途径参与生理调节过程[5-9]。在非生物胁迫方面，干旱、低温、高温、高盐、ABA、GA等均能不同程度的调控植物RING锌指蛋白的表达[10-14]。目前，对RING锌指蛋白的研究多集中在拟南芥、水稻、矮牵牛、大豆等几种植物中，关于小白菜RING锌指蛋白对铜胁迫的响应未见报道。本实验室前期研究结果表明，10 mg/L铜浓度对小白菜形态特征和生理生化指标均有明显的伤害作用，cDNA-AFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism）技术分析此浓度铜胁迫下小白菜基因的差异表达，得到了与小白菜铜胁迫相关的RING锌指蛋白基因TDF片段[15-18]。为阐述小白菜RING锌指蛋白在铜胁迫下的表达，本研究在cDNA-AFLP技术的基础上，运用RACE技术获得该基因的cDNA全长，并进一步研究该基因在铜胁迫下的表达变化，为研究小白菜响应铜胁迫分子机制及进一步开展抗逆遗传改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本试验供试小白菜品种为上海青，试验于2012年7～9月在福建农林大学园艺学院设施实验室进行。

1.1.2 试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、MseⅠ购自Fermentas公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，6%聚丙烯酰胺购自Solarbio公司，RevertAit First strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自Thermo公司，SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Clontech公司，pMD-18T Vector、E. coll DH5ɑ competent cells、SYBRR Premix Ex TaqTM试剂盒购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 将种子播于珍珠岩和草炭土按3 ∶ 18的比例混匀的穴盘中，待幼苗长到4～5片真叶时，选择长势一致的幼苗用清水洗去根部基质，然后用泡沫板固定至培养液中培养。培养液配制参考叶菜类营养液的标准配方[19]，其中Cu2+含量为10 mg/L。培养液每隔5 d更换1次，每次更换前取样。水培至0、5、10、15、20 d时采集第5片真叶（去除主叶脉），再用液氮充分冷冻后置于-80 ℃冰箱保存用于RNA提取。

1.2.2 小白菜总RNA提取与cDNA的合成 小白菜总RNA的提取参考Trizol试剂说明书，取1 μg的RNA反转录成cDNA。cDNA第一链的合成参考Thermo公司的RevertAit First strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行，合成3′RACE模板cDNA的引物为锚定引物；5′RACESMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明书进行。cDNA第二链的合成采用LD-PCR法进行，双链cDNA用紫外分光光度法检测。

1.2.3 cDNA-AFLP分析 cDNA-AFLP分析参照张凤云[20]的论文进行。取1 μL限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ对纯化后的cDNA进行双酶切。酶切产物可直接与已制备好的接头EcoRⅠ和MseⅠ16 ℃连接过夜。连接产物直接用于预扩增，预扩增产物稀释至10 ng/μL进行选择性扩增，然后用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带。将差异表达TDFs（Transcript Derived Fragments）进行回收、二次PCR后经连接、转化、验证后送上海博尚公司测序。测序后的TDFs核苷酸序列于NCBI上进行BLAST比对，预测其功能，筛选出与铜胁迫相关的基因。

1.2.4 基因全长的扩增及测序 差异表达TDFs功能分析发现1个与RING锌指蛋白相关的TDF片段。根据获得的TDF片段设计3′RACE和5′RACE引物（表1）进行嵌套PCR扩增，第1轮PCR扩增产物稀释10倍作为第2轮的模板。将所获得的目的片段回收、纯化后送到上海博尚公司测序。根据测序结果利用DNAMAN软件将5′RACE、3′RACE序列与TDF片段拼接成RING锌指蛋白的cDNA全长序列。在全长序列的3′UTR和5′UTR处设计特异引物RHZ-F、RHZ-R，克隆RING锌指蛋白基因的ORF，并进行序列校正。

1.2.5 生物信息学分析 利用相关软件分析RING锌指蛋白的氨基酸序列：用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源序列搜索，选取拟南芥、蒺藜苜蓿、芜菁、葡萄、大豆、鹰嘴豆、西红柿、黄瓜等同源性较高的锌指蛋白应用DNAMAN进行多序列比对；用MEGA5.2软件中的NJ法完成进化树的构建。用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）预测RING锌指蛋白基本的理化性质；用ProScal（http：//web.expasy.org/protscale/）默认算法（Hphob./Kyte&Doolittle）预测该蛋白的疏水性，用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构， SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽， 应用SOP-MA（http：// npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat. pl）、 ProtScale（http：//www.expasy.ch/tools/protscale/）预测其编码蛋白的二级结构和结构域， 用NCBI的Conserved Domains程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/）对该基因编码蛋白质进行保守区分析。

1.2.6 基因表达特性分析 将不同胁迫处理的RNA样品用SuperscriptTMШ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR试剂盒反转录成cDNA，稀释10倍后作为RT-PCR的模板。根据已获得的RING锌指蛋白基因全长设计特异性引物RHZrt-F和RHZrt-R，以小白菜Actin基因的actin-F和actin-R为内参引物。实时定量PCR（RT-PCR）的具体步骤参考大连宝生物工程有限公司的SYBR Premix ExTaq试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 小白菜铜胁迫cDNA-AFLP分析

对筛选出的多态性较好的135对引物组合进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，共筛选出180条差异表达TDFs，挑选差异较为明显的152条TDFs进行二次PCR扩增、回收、测序，最终得到151条有效序列。将获得的151条TDFs进行功能分析，结果发现1个与小白菜RING锌指蛋白相关的TDF，其表达量在铜胁迫后显著降低（图1）。测序结果表明，该TDF长度为267 bp（图2）。Blast分析结果表明，该片段与芜菁RING锌指蛋白的相似度高达98%，推测其可能是小白菜RING锌指蛋白cDNA上的1个片段。

2.2 RING锌指蛋白基因的克隆及序列分析

由图3可知，利用RACE技术获得524 bp的5′序列和328 bp的3′序列，将3′、5′序列与cDNA-AFLP技术获得的267 bp的TDF片段拼接后得到855 bp的RING锌指蛋白cDNA全长（GenBank accession： KF305521）。该序列包含1个长度为606 bp的开放阅读框，72 bp的5′UTR和177 bp的3′UTR序列，23 bp的Poly A，推测其编码202个氨基酸，含有起始密码子ATG和终止密码子TGA。特异引物RHZ-F、RHZ-R克隆ORF测序结果与拼接后的序列相一致。

2.3 RING锌指蛋白的生物信息学分析

用ProtParam软件预测，该基因编码的蛋白分子量为21.3 ku，理论等电点为6.87，理论推导半衰期为30 h，消光系数为13 115，不稳定指数为78.01，属于不稳定蛋白（参数大于40为不稳定蛋白）。该蛋白N-端33～55位氨基酸具有较强的疏水性，组成疏水跨膜α-螺旋，第1～32位氨基酸暴露于膜外，第56～202位氨基酸位于膜内，但N-端不存在肽酶切位点，不具备信号肽功能。

蛋白亚细胞定位是研究蛋白质功能很重要的方面，PSOT Prediction亚细胞定位结果显示，RING锌指蛋白定位于线粒体内膜的可信度为0.8，定位于叶绿体类囊体膜的可信度为0.7，定位于内质网膜的可信度为0.6，定位于线粒体膜间隙的可信度为0.225，由此可知，RING锌指蛋白定位于细胞内膜的可能性最大。

应用SOPMA预测其编码蛋白的二级结构，结果表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主，分别为37.62%和45.05%；延伸链和β转角较少，分别为13.37%和3.96%。

用ScanProsite在线软件进行功能区分析，并用NCBI的Conserved Domains程序对该基因编码蛋白质进行保守区分析，结果显示该蛋白C-端113～159位氨基酸处含有1个C3HC4型RING锌指结构。

2.4 RING锌指蛋白基因进化树分析

利用NCBI网站经Blast找到11条同源性高的锌指蛋白序列，这些序列来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、芜菁（Brassica rapa）、 葡萄（Vitis vinifera）、 大豆（Glycine max）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）、西红柿（Solanum lycopersicum）、 黄瓜（Cucumis sativus）， 一致性范围为40%～100%。多序列比对结果发现， RING锌指蛋白在N-端跨膜区和C-端RING锌指结构区较为保守（图5）。进化树分析结果显示，小白菜同芜菁（ABK56013.1）、 拟南芥（NP 173506.1、 XP 002890411.1）亲缘关系最近， 说明它们具有类似的结构和功能， 但与西红柿（XP 004238452.1）、黄瓜（XP004145558.1）的亲缘关系较远（图6）。

2.5 RING锌指蛋白基因在铜胁迫下的特异性表达

为研究小白菜对铜胁迫的应答，用Real-time PCR检测铜胁迫0、5、10、15、20 d的叶片中RING锌指蛋白的表达（图7），结果显示在铜胁迫下RING锌指蛋白基因的表达量显著降低，且在铜胁迫的早期其表达量就显著降低，表明RING锌指蛋白在感受到逆境胁迫后很早就参与到植物的逆境应答反应。

3 讨论与结论

锌指蛋白属于转录因子家族，普遍存在于植物中，是真核生物中总数最大的DNA结合蛋白，在植物防卫基因表达和抗逆反应上起重要作用，目前已鉴定的锌指蛋白大多属于C2H2型。本研究首次从小白菜中克隆了855 bp的C3HC4型RING锌指蛋白的cDNA全长序列，结构分析结果显示，该蛋白N-端ɑ螺旋区具有较强的疏水性，C-端具有一个RING锌指结构。其中RING结构域普遍具有泛素连接酶E3活性，能够与UbcH5c结合催化自身标签上的赖氨酸残基与泛素结合，发挥泛素连接酶E3活性，募集到特殊的泛素结合酶E2和底物[21-22]，植物细胞内80%～90%的异常蛋白都是通过泛素-蛋白酶体途径降解[24]。小白菜RING锌指蛋白在降解蛋白方面的功能有待进一步的研究。

RING锌指蛋白在调控植物防御生物和非生物胁迫反应上具有重要作用。许多研究结果证明，干旱、低温、高盐等逆境胁迫可以明显提高矮牵牛ZPT2-3[25]、水稻OsZFP1、OsRHC22[26-27]、降低了锌指蛋白与DNA结合的特异性，使基因处于较低表达状态，但其具体的响应机制尚不清楚，有待进一步研究。

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责任编辑：黄东杰