甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的克隆与表达分析

张玉叶等

摘 要 应用电子克隆技术，以烟草AAG59585序列为探针，获得了甘蔗苏氨酸脱氨酶（threonine deaminase）基因的全长cDNA，命名为ScTD。经RT-PCR扩增和验证，该基因序列与电子克隆结果一致性高达99%。序列分析结果表明：ScTD基因全长2 120 bp，具有完整的开放阅读框（ORF，164～1 681 bp），编码505个氨基酸，该基因编码蛋白定位于微体，为可溶性蛋白，不存在信号肽，二级结构原件多为α-螺旋，含有多个保守功能域，主要在氨基酸合成中发挥作用。电子表达分析结果显示，该基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、全株、芽和茎中组成型表达，其中在花序和根中的表达量最高。荧光定量PCR结果分析表明：该基因在甘蔗各组织中均有表达，且在根中的表达量最高。此外，该基因的表达受水杨酸胁迫后表达量最高，约为对照组的43.16倍，其次为聚乙二醇和茉莉酸甲酯，分别为6.90倍和4.40倍，推测该基因的表达与甘蔗抗病虫和抗渗透胁迫有关。此结果为甘蔗ScTD基因的克隆和功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用奠定基础。

关键词 甘蔗；苏氨酸脱氨酶基因；电子克隆；生物信息学；表达分析

中国分类号 S566.1 文献标识码 A

Cloning and Expression Analysis of Threonine

Deaminase Gene in Sugarcane

ZHANG Yuye， HUANG Ning， SU Weihua， XIAO Xinhuan， LUO Jun， QUE Youxiong*

Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture， Fujian Agriculture and Forestry University/

Sugarcane Research & Development Center， China Agriculture Research System， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract Using AAG59585 sequence from Nicotiana attenuata as the probe， the full-length cDNA sequence of one threonine deaminase gene termed as ScTD was cloned in silico from sugarcane（Saccharum Complex）. The sequence obtained from RT-PCR amplification had as high as 99% similarity with that from electronic cloning. The sequence analysis showed that the ScTD had a length of 2 120 bp containing an open reading frame（ORF， 164～1 681 bp）encoding 505 amino acids residues. The characters predicted based on the analysis of bioinformatics showed that the ScTD of sugarcane was a soluble acidic protein， which had two conserved functional domains with the main function for amino acid synthesis， and this protein was located in microbody. The main secondary structure element was α-helix. The electron expression analysis suggested that ScTD was constitutively expressed in different tissues of sugarcane， such as root tip， root collar， inflorescence， leaf， buds， whole plant and stem， especially higher in inflorescence and root. Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）analysis revealed that the expression of ScTD in root was higher than that in other organs， while the inducible expression level of ScTD was apparent under the stresses of salicylic acid（SA）， polyethylene glycol（PEG）and methyl jasmonate（MeJA）， approximately 43.16 times， 6.90 times and 4.40 times that of control group respectively， which suggested that ScTD involves in the diseases and pest resistance and osmotic stresses in sugarcane. The results in this study will provide the basis of cloning and functional identification of other members of ScTD in sugarcane and promote the use of ScTD gene in sugarcane genetic engineering.

Key words Sugarcane； Threonine deaminase gene； In silico cloning； Bioinformatics； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.011

苏氨酸脱氨酶（threonine deaminase，TD）也叫苏氨酸脱氢酶（threonine dehydratase）。在植物和细菌中生物合成的苏氨酸脱氨酶包含一个N端磷酸吡哆醛结合催化域和C端调控域，该酶在原核细胞及真核细胞中均可能与甘氨酸C-乙酰基转移酶（glycine C-acetyltransferase）结合成为复合物协同作用，将苏氨酸转化生成α-酮丁酸和氨，然后以α-酮丁酸为反应物合成异亮氨酸，此途径即为异亮氨酸合成的关键步骤[1]。L-异亮氨酸是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，在食品和医药行业中具有广泛的应用及商业价值[2]。苏氨酸脱氨酶受异亮氨酸的负反馈调控[3]。目前，该酶在大肠杆菌、鼠伤寒杆菌、谷氨酸棒杆菌等[4-5]细菌中已有报道。在植物中，苏氨酸脱氨酶与植物抗虫有关，分别在番茄等茄科植物[6]，烟草[7]中有相关报道，但在甘蔗中尚未见有关苏氨酸脱氨酶的报道。

电子克隆（in silico cloning）是通过EST或基因组的序列组装和拼接，快速地获得目标基因部分或全长cDNA序列的技术。该技术在人、鼠和水稻等[8-9]EST丰富的模式生物中首先得到运用，随后在植物中运用此技术获得新基因的报道日益增加，此技术在甘蔗中也得到了有效利用[10-11]。电子表达分析是通过某物种特定基因所有相关表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）的整合分析，从而获得该基因表达相关信息的一种新型基因表达分析技术。目前，电子表达分析与电子克隆技术结合起来挖掘新基因和分析基因功能已被成功应用于包括甘蔗等多种植物目标基因的表达分析[12]。本研究以甘蔗为材料，电子克隆与实验验证结合获得甘蔗苏氨酸脱氨酶基因，并对其功能进行探讨，为异亮氨酸的生产以及研究该基因在甘蔗抗逆性中的作用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗品种新台糖22号（ROC22）由福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提供。

1.1.2 试剂 PrimeScriptTM RT-PCR Kit反转录试剂盒、SYBR R Green PCR Master Mix Kit （Roche）均购自大连宝生物（TaKaRa）公司。

1.2 方法

1.2.1 植物材料处理 从田间选取3株健康、长势一致的ROC22植株，整株取回。将根部的泥土洗净，选取白色的幼根作为材料。用于组织表达的材料为甘蔗第七或第八节，分别取蔗芽，蔗皮，蔗髓，第一片叶的叶片和叶鞘。研究目的基因受不同外源胁迫后的表达特性时，将ROC22蔗茎作为种茎，砍成单芽茎段后，采用沙培法，在塑料大棚中育苗至其长出第四或第五叶。选取长势一致的蔗苗水培1周，分为对照和4种胁迫组，每组每个时间点均设3株蔗苗，作为生物学重复。胁迫组处理条件为水杨酸（salicylic acid，SA）（5 mmol/L）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）（100 μmol/L）、脱落酸（abscisic acid，ABA）（100 μmol/L）、模拟干旱（PEG8000）（25.0%），每1 h喷撒叶面1次，未处理的蔗叶作为对照。分别取6 h后各小组内3棵蔗苗的蔗叶。以上所有植物材料均立即投入-80 ℃液氮中保存，备用。

1.2.2 电子克隆获得基因序列 以烟草TD基因（AAG59585）蛋白序列作为探针，运行NCBI的tblastn检索甘蔗EST数据库，获得与之相似的甘蔗EST序列群，用BioEdit中的contig assembly program（CAP）（http：//pbil. univ-lyon1.fr/cap3.php）软件拼接组装为重叠群（contig），获得组装全长cDNA序列的EST候选清单。然后以最终拼好的contig重叠群为新探针，再次进行搜索，直到没有新的甘蔗EST可供拼接为止。最后利用NCBI的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）服务器，对最终所获得的cDNA序列进行开放阅读框分析并进行翻译。

1.2.3 甘蔗TD基因的RT-PCR及测序 采用Trizol法提取甘蔗ROC22叶片的总RNA。用反转录试剂盒合成cDNA，作为PCR的模板。以上述电子克隆获得的cDNA 序列为模板，设计一对特异性RT-PCR扩增引物，5′端引物（5′-TGCCCGTGACAA

CGCCAGAA-3′）和3′端引物（5′-GGTGCCGCAAACC

GATAAA-3′）。PCR反应体系为25 μL：10×GC Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，引物（20 μmol/L）各1.0 μL，Ex Taq酶0.2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR反应程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。用Gel Extraction Kit对扩增产物进行纯化回收，并与pMD-19T载体连接转化至DH5α感受态细胞中，在抗性Ampr的LB平板上筛选阳性克隆，随机挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，将阳性单菌落菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4 甘蔗ScTD基因序列的生物信息学分析

利用ExPASy中ProtParam pI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi/）在线工具对序列的理化性质、氨基酸组成等一级结构进行预测，利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽分析，ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）进行疏水性/亲水性预测，Profun 2.2 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）进行功能预测，编码蛋白亚细胞定位用Psort（http：//www.psort.org/）在线工具预测，GOR IV（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）二级结构预测，SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）进行蛋白质三级结构预测，Blast上查找氨基酸同源性序列。

1.2.5 甘蔗ScTD基因的电子表达分析 根据植物EST序列组织来源或胁迫材料的来源不同，进行电子表达分析，分析该基因组织特异性表达或生物、非生物胁迫后表达特性[12]。

1.2.6 甘蔗ScTD基因的荧光定量PCR分析 采用Trizol 法提取ROC22叶片、叶鞘、侧芽、蔗皮、蔗髓、根及经SA、MeJA、ABA、PEG胁迫处理和对照组ROC22叶片的总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，作为荧光定量PCR模板，以25 S rRNA作为内参基。合成荧光定量引物5′端引物（5′-TGC

AATGGCATTATCCTTGT-3′）和3′端引物（5′-TGACA

GCTACACCATCAGCA-3′），25S rRNA的5′端引物（5′-TGCTTTGCTCGGTTTATAGC-3′）和3'端引物（5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′）[13]。按照SYBR R Green PCR Master Mix Kit（Roche）说明书配置定量反应体系。荧光定量PCR扩增程序为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45个循环，设3次重复。

1.3 数据处理

使用DNAMAN软件，将重组质粒序列与电子克隆序列进行同源性比对。并用DNAMAN软件分析氨基酸同源性及多序列比对，完成并构建系统进化树。在Excel工作表中采用 2-△△CT算法[14-15]分析荧光定量PCR实验结果，画图并计算3次重复数据的标准误。

2 结果与分析

2.1 甘蔗ScTD基因的获得

电子克隆得到一个全长为2 120 bp的基因序列（图1），该cDNA序列具有完整的开放阅读框（ORF，164～1 681 bp），编码505个氨基酸，说明此序列为一条完整的甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的cDNA序列，命名为ScTD。

经过RT-PCR 扩增获得了约1 400 bp的单一条带（图2），经克隆与测序，证实其序列与电子克隆所获得的序列一致性达到99%，仅有14个碱基不同，经推测可能是在PCR扩增时碱基错配造成的。因此，推测电子克隆所获得的甘蔗ScTD基因序列是正确的。

2.2 甘蔗ScTD基因的生物信息学分析

2.2.1 甘蔗ScTD基因编码氨基酸的一级结构预测

甘蔗ScTD基因编码氨基酸进行一级结构预测，结果见表1。

2.2.2 甘蔗ScTD蛋白二级结构预测和分析 结果见表2。表2显示，α-螺旋所占的比例最高为45.64%，其次是无规则卷曲占37.15%和最低的延伸链占比例17.19%。

2.2.3 甘蔗ScTD蛋白信号肽预测和分析 结果见表3所示。第48位苯丙氨酸残基具有最高的原始剪切位点分值0.126和最高的信号肽分值0.109，第24 位丙氨酸残基具有最高的综合剪切位点分值0.131。由于最后算得氨基酸残基的加权平均值较小，为0.103（远远<0.5），则推测ScTD基因所编码的蛋白不存在信号肽，而为非分泌蛋白，说明该蛋白在细胞质中合成后，不能进行蛋白转运。

2.2.4 甘蔗ScTD蛋白疏水性/亲水性的预测和分析

由图3可知，第185位具有最高分值，为2.300，疏水性最强；第361位和第499位具有最低分值，为-2.322，亲水性最强。整条多肽链表现为亲水性，没有明显的疏水区，故推测甘蔗ScTD蛋白是一种亲水蛋白。

2.2.5 甘蔗ScTD蛋白质三级结构预测 ScTD蛋白的空间结构以无规则卷曲和螺旋为主（图4）。比较甘蔗、高粱、玉米和水稻中TD蛋白的三级空间结构虚拟图，结果显示，甘蔗的三级空间结构与高粱、玉米和水稻蛋白的三级空间结构高度相似。 2.2.6 甘蔗ScTD蛋白的功能预测 该蛋白的最主要功能为氨基酸生物合成，也有一定可能性参与了辅酶因子生物合成、翻译能量代谢及脂肪酸代谢（表4）。由于苏氨酸脱氨酶是异亮氨酸合成的关键酶之一，则预测结果与实际相符。

2.2.7 甘蔗ScTD蛋白的亚细胞定位 甘蔗ScTD蛋白可能定位于微体的过氧化酶体中（表5）。

2.2.8 甘蔗ScTD蛋白的保守结构域分析 如图5所示，甘蔗ScTD蛋白包含2个保守结构域，分别为Trp-synth-bete_ⅡSuperfamily和ACT Superfamily。这和前文所提到此基因在植物和细菌中N端和C端的结构特征相符[1]。

2.2.9 甘蔗ScTD蛋白的氨基酸同源性分析 对甘蔗ScTD蛋白的氨基酸进行同源性分析。在结果中选择高粱（Sorghum bicolor_gb|XP_002466574.1|）、玉米（Zea mays_gb|DAA51003.1|）、水稻（Oryza sativa Japonica Group_gb|AAL 58211.1|）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon_gb|XP_003559531.1|）、番茄（Solanun lycopersicum_gb|NP_ 001234234.1|）、毛杨果（Populus trichocarpa_gb|XP_002326230.1|）和黄瓜（Cucumis sativus_gb|XP_004143291.1|）进行分析，蛋白的氨基酸序列相似性分别为98%、96%、94%、88%、80%、80%和76%。

从图6可以看出，同属单子叶植物的甘蔗和高粱同源性最高。系统进化树显示（图7）：单子叶植物甘蔗、玉米、水稻和二穗短柄草为一分支，同属双子叶植物的番茄、黄瓜和毛杨果为另一分支。因此，该基因在不同物种间具有很强的保守性，它们对应的蛋白属于同一个家族。

2.3 甘蔗ScTD基因的表达分析

2.3.1 甘蔗ScTD基因的电子表达分析 电子表达分析结果见图8。图8显示，甘蔗ScTD基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、茎、全株和芽中组成型表达，其中在花序中的表达量比其他类型组织表达量高。此外，该基因的表达受葡萄糖杆菌调控。

2.3.2 甘蔗ScTD基因的荧光定量PCR表达分析

分析甘蔗ScTD基因在不同组织中的表达，结果见图9所示。由图9可知，该基因在不同组织中均有表达，在蔗髓中表达量最少；其次是芽中；根中表达量最高，是蔗髓中的51.02倍，是芽中表达量的10.87倍。分析甘蔗ScTD基因在不同胁迫下的应答反应，结果见图10。由图10可知，该基因在不同胁迫下的相对表达量呈上调趋势，其中在水杨酸胁迫下的相对表达量最高，为对照组的43.16倍，其次是在聚二乙醇和茉莉酸甲酯胁迫下的表达量，分别为6.90和4.40倍。推测该基因表达与甘蔗的抗病性和渗透有关，与前人的报道相符[6-7]。

3 讨论与结论

本研究采用电子克隆与实验克隆相结合的方法，成功地克隆了甘蔗ScTD基因，重组子序列与电子克隆序列同源性高达99%，推测本研究电子克隆所获得的序列是正确的，进一步证明电子克隆与实验克隆相结合是发现新基因的有效途径。而后，采用多种生物信息学手段分析了该基因的特性，甘蔗ScTD基因在不同物种间具有较强的保守性，不同物种相应的蛋白同源序列均达到80%左右。所编码的蛋白位于微体，为亲水、非分泌酸性蛋白，在调控异亮氨酸的生物合成中发挥关键作用。

本研究利用Unigene数据库分析了甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的电子表达，检索到22条同源性较高的EST序列，甘蔗EST数据库中包含了283 951条EST，已经能够非常好地覆盖了甘蔗的全基因组，此结果能够如实反映该基因在甘蔗基因组中的表达情况。电子表达分析结果显示，该基因在花序和根中都有很高的表达量，这与荧光定量PCR结果大体一致，都是在根中相对表达量高，说明电子表达分析技术可以用于甘蔗中目的基因的表达分析，这与本课题组以往的的研究结果一致[12]。

水杨酸（SA）在超敏反应（hypersensitive response，HR）中能介导导致细胞死亡的氧化迸发（oxidative burst），诱导病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因的表达，引发系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）的产生，并且能诱导一些防卫基因（如PR）的激活或表达[16]。PEG为一种理想的模拟渗透胁迫物质[17]。茉莉酸和茉莉酸甲酯能够诱导植物产生对害虫有毒、抗营养和抗消化作用的化合物，对害虫生理活动产生不利影响[18]。本文通过荧光定量PCR实验对甘蔗ScTD基因在不同组织和不同胁迫下的相对表达量行进分析。不同组织中的表达分析结果显示，该基因在蔗髓、蔗皮、侧芽、叶片、叶鞘和根中都有表达，其中在根中的相对表达量最高，芽次之。在SA、ABA、MeJA和PEG等胁迫下的表达分析结果显示，该基因在本实验所有胁迫下均上调表达，其中SA胁迫下的相对表达量最高，PEG和MeJA胁迫下的表达量次之。有研究结果表明，氨基酸合成所需的氮素主要来源于大气和土壤，根吸收土壤中的硝酸盐，以此来进行氮代谢[19]，而苏氨酸脱氨酶是合成异亮氨酸关键酶之一，主要作用为氨基酸的合成，这可能是该基因在根中表达量会相对其他组织要高的原因。芽的生长发育需要较多氨基酸，推测这是苏氨酸脱氨酶在芽中相对含量较高的原因。因此，本研究推测苏氨酸脱氨酶基因与甘蔗的抗病虫和抗渗透胁迫存在一定的关联性。

综上所述，本研究采用电子克隆与实验验证的方法成功克隆到甘蔗ScTD基因，并进行了该基因的生物信息学分析、电子表达分析和荧光定量PCR分析。研究结果为甘蔗中ScTD基因功能的深入解析及其应用积累了基础资料。

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责任编辑：赵军明